ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2015, том 70, № 4, с. 359-364
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 543.544
ПРОБОПОДГОТОВКА 0иЕСЬЕК8 ПРИ ОДНОВРЕМЕННОМ ОПРЕДЕЛЕНИИ ДИЭТИЛСТИЛЬБЭСТРОЛА И РАКТОПАМИНА В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ
ХРОМАТОГРАФИИ
© 2015 г. В. Г. Амелин*, **, 1, Д. С. Королёв*, А. В. Третьяков*
*Федеральный центр охраны здоровья животных 600901 Владимир, мкр. Юрьевец **Владимирский государственный университет им. Александра Григорьевича и Николая Григорьевича Столетовых
600000 Владимир, ул. Горького, 87 1Е-таИ: amelinvg@mail.ru Поступила в редакцию 26.02.2014 г., после доработки 30.08.2014 г.
Предложена простая и экспрессная методика определения 1—25 мкг/кг диэтилстильбэстрола и Р-ад-реностимулятора рактопамина в пищевых продуктах методом газожидкостной хроматографии с детектором по захвату электронов. Извлечение целевых компонентов проводили по методу QuEChERS, доочистку экстракта и концетрирование при определении диэтилстильбэстрола — дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракцией тетрахлорметаном. Степень извлечения 92—110%, коэффициент концентрирования 40. Продолжительность анализа 1.5—2 ч, относительное стандартное отклонение результатов анализа не превышает 0.1.
Ключевые слова: диэтилстильбэстрол, рактопамин, газожидкостная хроматография, детектор по захвату электронов, QuEChERS, дисперсионная жидкостно-жидкостная микроэкстракция.
Б01: 10.7868/80044450215040027
Применение в животноводстве диэтилстильбэстрола (ДЭС) и рактопамина (РТП) приводит к ускоренному наращиванию мышечной массы животных, что способствует получению постного мяса. При применении синтетических веществ данного типа существует риск воздействия на здоровье человека их остаточных количеств в продуктах животноводства [1].
Для определения следовых количеств ДЭС и РТП в пищевых продуктах используют высокоэффективную жидкостную хроматографию в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ВЭ—ЖХ—МС—МС) и газожидкостную хромато-масс-спектрометрию (ГХ—МС—МС), однако эти методы предусматривают большой расход токсичных органических растворителей при пробо-подготовке, характеризуются высокой стоимостью и требуют высококвалифицированного персонала [2—6]. Для скрининга данных препаратов применяют также иммуноферментный анализ продолжительностью до 21 ч [7, 8]. Основным способом пробоподготовки в указанных методах является жидкостно-жидкостная экстракция с последующей очисткой экстракта твердофазной
экстракцией. Данный процесс достаточно длителен, трудоемок и требует большого расхода токсичных органических растворителей и одноразовых картриджей.
В последнее время для определения примесей в пищевых продуктах используют способ пробо-подготовки QuEСhERS — извлечение целевых компонентов ацетонитрилом с последующей очисткой экстракта насыпными сорбентами. Впервые метод был применен в 2003 г. при определении пестицидов в фруктах [9]. Данный прием пробоподготовки из-за недостаточной очистки экстрактов от матрицы чаще всего комбинируют с методами ВЭЖХ-МС-МС и ГХ-МС-МС. Для жидких проб часто используют дисперсионную жидкостно-жидкостную микроэкстракцию
(ДЖЖМЭ) - дешевый, быстрый и простой способ концентрирования, который позволяет существенно снизить объемы растворителей, время и трудозатраты на анализ по сравнению с классическим вариантом [10].
В данной работе показана возможность сочетания ускоренной, безопасной и упрощенной пробоподготовки QuEChERS с доочисткой и
концентрированием экстракта ДЖЖМЭ при определении РТП и ДЭС в пищевых продуктах методом газожидкостной хроматографии с детектором по захвату электронов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Аппаратура. Использовали газовый хроматограф ХРОМОС ГХ-1000 с детектором по захвату электронов (Россия). Разделение проводили на капиллярной колонке ValcoBond® VB-5 (VICI, США) длиной 30 ми внутренним диаметром 0.32 мм (толщина пленки неподвижной фазы 0.5 мкм). Температура колонки 120—300°C (скорость нагрева 8.5 град/мин), температура испарителя 240°C, детектора — 300°C. Газ-носитель азот, расход 38 мл/мин. В хроматограф вводили 1 мкл пробы без деления потока.
Реактивы. Использовали ДЭС (Dr. Ehrenstorfer GmbH, Германия), РТП гидрохлорид (Eli Lilly and Company, США), ацетонитрил для хроматографии (Merck, Германия), толуол, триэтиламин (ТЭА), дихлорметан, трифторуксусный ангидрид (ТФА), сульфат магния х. ч., хлорид натрия х. ч., натрий лимоннокислый трехзамещенный двойной гидрат х. ч., натрий лимоннокислый двухза-мещенный полуторный гидрат х.ч., сорбенты Su-perclean ENVI-Carb PSA, С18.
Растворы с концентрацией 10 мг/мл готовили растворением соответствующей навески ДЭС в толуоле и РТП в этаноле. Для построения градуи-ровочного графика в микрофлаконы вводили 5, 10, 25, 50, 80, 100 мкл рабочего раствора с концентрацией 10 мкг/мл, выпаривали досуха, сухой остаток растворяли в 1 мл смеси (70 : 10 : 1) толуола, ТФА и 10%-ного толуольного раствора ТЭА, плотно закрывали, оставляли в сушильном шкафу на 15 мин при 60°C для ДЭС и на 20 мин при 80°C для РТП.
Пробоподготовка. В центрифужную пробирку емк. 50 мл вносили навеску измельченного и усредненного образца массой 10.0 г, добавляли 10.0 мл ацетонитрила, закрывали пробирку и энергично взбалтывали в течение 1 мин. Затем вносили смесь 4.0 г MgSO4, 1.0 г NaCl, 1.0 г Na3C6H5O7 • 2H2O и 0.5 г Ш2С6Н6О7 • 1.5Н2О. После внесения солей пробирку встряхивали в течение 1 мин во избежание образования комков и центрифугировали в течение 5 мин при 3000 об/мин, отбирали 7.0 мл верхней части экстракта и переносили в центрифужную пробирку емк. 15 мл, которая содержала смесь MgSO4 (0.9 г), сорбентов Bonde-sil-PSA (0.15 г) и С18 (0.15 г). Пробирку энергично встряхивали в течение 30 с и центрифугировали 7 мин при 2700 об/мин.
При определении ДЭС отбирали 2.0 мл полученного экстракта, добавляли к нему 200 мкл тет-рахлорметана и впрыскивали полученную смесь с
помощью шприца в 5 мл бидистиллированной воды, воздействовали ультразвуком в течение 4 мин, центрифугировали 7 мин при 2700 об/мин. Нижний слой экстракта переносили в микрофлакон и упаривали досуха в токе азота. Полученный сухой остаток растворяли в 50 мкл толуола, содержащего ТФА и ТЭА (70 : 10 : 1), выдерживали 15 мин при 60°С, охлаждали и хроматографировали.
При определении РТП отбирали 2.0 мл полученного экстракта, переносили в микрофлакон и упаривали досуха в токе азота. Полученный сухой остаток растворяли в 50 мкл толуола, содержащего ТФА и ТЭА (70 : 10 : 1), выдерживали 20 мин при 80°С, охлаждали и хроматографировали.
Для характеристики эффективности пробопод-готовки использовали степень извлечения (К):
с V
Я = ^ х100,
с V
о о
где ск и со — концентрация аналита в конечном анализируемом растворе и начальная концентрация аналита в исходной пробе, Ук и Уо — объемы конечного анализируемого раствора-концентрата и пробы.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ДЭС и РТП имеют в своей структуре гидроксо-группы и легко ацилируются трифторуксусным ангидридом. Полученные производные летучи и дают отклик в детекторе электронного захвата.
OH
HO
HO.
ДЭС
OH
OH
РТП
Выбор оптимальных условий получения производных. Изучено влияние объема добавляемого ТФА (25, 50, 100 мкл), температуры (20, 40, 60°С), количества внесенного ТЭА и продолжительности реакции (5, 10, 15, 20 мин) на площадь хрома-тографического пика целевых компонентов.
Одним из наиболее важных параметров, влияющих на площади пика, оказалась концентрация внесенного акцептора протонов ТЭА. Из рис. 1 следует, что оптимальная концентрация ТЭА составляет 1% (объем стандартного раствора, содержащего 50 мкл ТФА, составлял 400 мкл), что соответствует смеси (70 : 10 : 1) толуола, ТФА и ТЭА. Оптимальной температурой для получения про-
ПРОБОПОДГОТОВКА QuEChERS
361
S, мВ мин 2.5
200
0 2 4 6 8 10
с, %
Рис. 1. Зависимость площади хроматографического пика РТП (1) и ДЭС (2) от концентрации ТЭА.
180
В
а, 160 р
о
кто
тек140
ет
д
к 120 От100
80
^2
1
(¿и
11111
12
14
16
18 20 Время, мин
1
2
изводных ДЭС является 60°^ а для получения производных РТП - 80°^ При этой температуре наблюдается один пик на хроматограмме производных РТП, что свидетельствет о преимущественном протекании реакции в одном направлении с образованием одного продукта (рис. 2).
Оптимальная продолжительность реакции получения производных ДЭС составляет 15 мин, а производных РТП - 20 мин. Полученные данным способом производные ДЭС стабильны в течение 2 ч, РТП - 4 ч. Со временем концентрация целевых компонентов в смеси падает, однако за двое суток их концентрация снижается не более чем на 30%.
Извлечение и концентрирование определяемых компонентов из матриц методом ОиЕСЙЕЯ8. Экстракт, полученный методом QuEChERS, необходимо концентрировать и во многих случаях дополнительно очищать. Для этой цели опробовали дисперсионную жидкостно-жидкостную микроэкстракцию. ДЖЖМЭ оказалась неприменимой для определения рактопамина из-за его высокого сродства к полярным растворителям и соответственно низкой степени извлечения (менее 40%). В связи с этим экстракт, очищенный по методу QuEChERS, концентрировали упариванием досуха в токе азота, используя разбавление в меньшем объеме подвижной фазы.
Оптимизация условий дисперсионной жидкост-но-жидкостной микроэкстракции при определении ДЭС. Оптимальные условия ДЖЖМЭ выбирали по наибольшим площадям хроматографических пиков. В качестве экстрагента использовали бензол, трихлорметан, дихлорметан и тетрахлорме-тан, в которых растворимость ДЭС выше, чем в ацетонитриле. Наибольшие площади хромато-графических пиков получены при использовании тетрахлорметана. Объем вводимого тетрахлормета-на варьировали от 100 до 300 мкл. Микроэкстракцию проводили при постоянном объеме дисперга-
Рис. 2. Хроматограммы стандартных растворов три-фторацильных производных РТП, полученных при 60 (1) и 80°0 (2).
тора (2 мл ацетонитрила). Установлено, что оптимальный объем экстрагента составляет 200 мкл.
В данной работе ДЖЖМЭ сочетали с методом QuEChERS, поэтому в качестве диспергатора использовали только ацетонитрил. Степень концентрирования аналита тем выше, чем больше объем диспергатор
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.