ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 636.085.3:577.18:543
ПРОБОПОДГОТОВКА 0иЕСЬЕК8 ПРИ ОДНОВРЕМЕННОМ ОПРЕДЕЛЕНИИ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ХИНОЛОНОВ, СУЛЬФАНИЛАМИДОВ И АМФЕНИКОЛОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ МЕТОДОМ ВЭЖХ
С ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ С ПОМОЩЬЮ ДИОДНОЙ МАТРИЦЫ © 2015 г. В. Г. Амелин*, 1, Н. М. Волкова*, **, А. А. Тимофеев*, **, А. В. Третьяков**
*Владимирский государственный университет им. Александра Григорьевича и Николая Григорьевича Столетовых 600000 Владимир, ул. Горького, 87 1Е-таИ: amelinvg@mail.ru **Федеральный центр охраны здоровья животных (ВНИИЗЖ)
600901 Владимир, мкр. Юрьевец Поступила в редакцию 01.03.2014 г., после доработки 10.07.2014 г.
Предложен способ одновременного определения антибиотиков хинолонового ряда (эноксацин, да-нофлоксацин, ломефлоксацин, энрофлоксацин, дифлоксацин, оксолиновая кислота), сульфаниламидной группы (сульфаниламид, сульфадиазин, сульфапиридин, сульфамеразин, сульфахлорпи-ридазин, сульфадиметоксин, сульфаквиноксалин) и амфениколов (хлорамфеникол, флорфеникол и тиамфеникол) в пищевых продуктах методом ВЭЖХ с детектированием с помощью диодной матрицы при 228 и 280 нм из одной навески с использованием упрощенной, быстрой и безопасной про-боподготовки QuEChERS. Диапазоны определяемых содержаний хинолонов при навеске 5 г составили 0.01—2 мг/кг, сульфаниламидов и амфениколов 0.002—1 мг/кг. Относительное стандартное отклонение результатов анализа не превышает 0.1. Продолжительность анализа 1 — 1.5 ч.
Ключевые слова: антибиотики хинолонового ряда, сульфаниламиды, амфениколы, пищевые продукты, ВЭЖХ, детектор с диодной матрицей.
Б01: 10.7868/80044450215090029
Антибиотики применяют для лечения инфекционных заболеваний у людей и животных, а также в качестве стимуляторов роста в животноводстве, поэтому их остаточные количества могут встречаться в пищевых продуктах животного происхождения [1]. Основными классами антибиотиков, используемых в ветеринарии, являются хино-лоны, амфениколы и сульфаниламиды. Употребление в пищу продуктов, содержащих остаточные количества антибиотиков, негативно сказывается на организме человека и в связи с этим их содержание нормируется [2].
В настоящее время предложено множество методов определения сульфаниламидов и амфени-колов, среди которых можно выделить методы капиллярного электрофореза и ВЭЖХ [3—6], в которых очистку экстракта проводят с использованием твердофазной экстракции [7, 8], а также хромато-масс-спектрометрические методы одновременного определения остаточных количеств антибиотиков различных классов [9—11]. Первая группа методов предполагает использование боль-
шого количества токсичных органических растворителей, вторая — применение дорогостоящего сложного оборудования. Предложен способ определения пяти хинолонов (марбофлоксацин, дифлоксацин, норфлоксацин, энрофлоксацин и ци-профлоксацин) методом ВЭЖХ с детектированием с помощью диодной матрицы (ВЭЖХ-ДМД) в мясе и яйцах. Для извлечения антибиотиков из проб использовали ацетонитрил, очистку экстракта и концентрирование методом твердофазной экстракции [12]. Предложено также определение 13 хинолонов в кормах методом ВЭЖХ с детекторами ДМД, флуориметрическим и пробоподготов-кой c использованием твердофазной экстракции [13]. Перечисленные способы длительны и трудоемки, что не позволяет анализировать большое количество образцов за короткое время.
Известный с 2003 г. способ дисперсионной твердофазной экстракции QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe — быстрый, простой, дешевый, эффективный, точный и надежный), изначально применявшийся для выделения
Таблица 1. Данные об определении остаточных количеств антибиотиков в пищевых продуктах с использованием пробоподготовки QuEChERS
Антибиотик Матрица R, % Метод определения; колонка Смиш мкг/г Сн, мкг/г Литература
Сульфаниламиды: СДЗ, СДМ, СМЗ, СМТ3, САМ, СПД, СТЗ Креветки 58-133 ВЭЖХ-МС; (50 х 4.6 мм) RR Zorbax Eclipse XDB-C18 (1.8 мкм) 0.00006-0.0007 [15]
Сульфаниламиды: СДЗ, СДМ, СПД, СМО, СТЗ, СВК, СМЗ, СМТ, СХПД Мясо 25-50 ВЭЖХ-МС, ВЭЖХ-МС/МС; (75 х 4.6 мм), Symmetry C18 (3.5 мкм) 0.025-0.050 [16]
Сульфанилами-ды:СВК, СДМ, СТЗ, СМТ, СДЗ, СХПД Молоко, мясо, печень, силос 10-100 УВЭЖХ-МС/МС; 1.9 мкм (2.1х50 мм), Hypersil Gold AQ 0.001-0.1 [17]
Сульфаниламиды: СХПД, СДЗ, СДМ, СДК, СМР, СМТ, СМО, СМТП, САМ, СВК, СТЗ, ССЗ Корма 86-106 ВЭЖХ-МС/МС; (4.6 х150 мм) Zorbax Eclipse XDB C18 (5 мкм) 0.0009-0.0071 [18]
Амфениколы: ХЛФ, ФЛО, ТИА Молоко 86-110 ВЭЖХ - ДМД; (150 х 4.6 мм) KINETEX™ (2.6 мкм) 0.007-0.012 0.020-0.046 [19]
Обозначения: САМ — сульфаниламид, СДЗ — сульфадиазин, СДК — сульфадоксин, СДМ — сульфадиметоксин, СМЗ — суль-фамезазин, СМО — сульфаметоксазол, СМР — сульфамеразин, СМТ — сульфаметазин, СМТ3 — сульфаметизол, СМТП — сульфаметоксипиридазин, СПД — сульфапиридин, ССЗ — сульфисоксазол, СТЗ — сульфатиазол, СВК — сульфаквиноксалин, СХПД — сульфахлорпиридазин, ХЛФ — хлорамфеникол, ТИА — тиамфеникол, ФЛО — флорфеникол, УВЭЖХ — ультра высокоэффективная жидкостная хроматография.
пестицидов [14], в настоящее время используется и для извлечения остаточных количеств антибиотиков. Экстракцию целевых компонентов проводят ацетонитрилом в присутствии буфери-рующих солей. Очистку экстрактов от липидов, жиров и белков осуществляют насыпными сорбентами Вопёе8П-Р8А, С18, графитированной сажей, ионообменными смолами и их комбинациями. QuEChERS позволяет значительно сократить продолжительность пробоподготовки, нет необходимости применения дополнительных способов подготовки и очистки, метод характеризуется высокой степенью извлечения широкого спектра антибиотиков. Простота метода обеспечивает высокую надежность и воспроизводимость, позволяет снизить затраты органических растворителей. Однако в настоящее время такой способ извлечения целевых компонентов и последующего анализа используется в основном при сочетании ВЭЖХ с масс-спектрометрией (МС) (табл. 1).
В данной работе изучено сочетание QuEChERS и ВЭЖХ-ДМД для одновременного определения сульфаниламидов, амфениколов и хинолонов в пищевых продуктах из одной навески.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Аппаратура. В работе использовали жидкостной хроматограф с ДМД Flexar DAD (Perkin-Elm-er, США). Разделение проводили на колонке (250 х 4.6 мм) SUPELCOSIL™ LC-18 (5 мкм) (Sigma-Aldrich, США) в режиме градиентного элюирования.
Реактивы. Использовали стандартные образцы антибиотиков: сульфаниламид, данофлокса-цин, оксолиновая кислота (Dr. Ehrenstorfer GmbH, Германия), сульфадиазин, сульфапиридин, сульфамеразин, сульфахлорпиридазин, сульфадиметоксин, сульфаквиноксалин, дифлоксацин (Fluka, Германия), хлорамфеникол, флорфеникол, тиам-феникол (Sigma, Германия), эноксацин, ломе-флоксацин, энрофлоксацин (Sigma, Китай). Стандартные растворы с концентрацией 10 мкг/мл готовили в ацетонитриле. Использовали ацетонитрил для хроматографии, дигидрофосфат калия (Merck, Германия), сульфат магния х. ч., хлорид натрия х. ч., натрий лимоннокислый трехзамещенный двойной гидрат х. ч., натрий лимоннокислый двухзамещен-ный полуторный гидрат х. ч., сорбенты Bondesil-PSA (Varian, США) и С18 (Supelco, США), ацетат натрия (Dudley Chemical, Россия).
шли 70
60
50
40
30
20
10
0
1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0
Время, мин
Рис. 1. Хроматограмма модельной смеси растворов антибиотиков (10 мкг/мл): 1 — эноксацин, 2 — данофлоксацин, 3 -ломефлоксацин, 4 — энрофлоксацин, 5 — оксолиновая кислота, 6 — хлорамфеникол, 7 — дифлоксацин.
Пробоподготовка. Исследуемые пробы измельчали миксером. В центрифужную пробирку емк. 50 мл вносили навеску анализируемой пробы 5.0 г, добавляли 10.0 мл ацетонитрила, 0.1 мл конц. НСООН, закрывали пробирку и энергично взбалтывали в течение 1 мин. Затем вносили смесь 4.0 г М§804, 1.0 г ШС1, 1.0 г Ш3С6Н507 • • 2Н20 и 0.5 г Ш2С6Н6О7 ■ 1.5Н2О. Содержимое пробирки взбалтывали в течение 1 мин (во избежание образования комков) и центрифугировали в течение 5 мин при 4500 об/мин. Отбирали 5 мл верхней части экстракта и переносили в центрифужную пробирку емк. 15 мл, которая содержала смесь сорбента Вопёе8П-Р8А (0.15 г), С18 (0.15 г) и М§804 (0.9 г). Пробирку энергично встряхивали в течение 1 мин, центрифугировали 5 мин при 2700 об/мин, отбирали по 1 мл экстракта в микрофлакон, упаривали в токе азота досуха, остаток растворяли в 100 мкл подвижной фазы и хроматогра-фировали. Условия определения хинолонов и хло-рамфеникола: температура термостата колонки 35°С; подвижная фаза 20 мМ дигидрофасфата калия, 1.2 г/л 1-гептансульфоната натрия (рН 2.2), ацетонитрил; содержание ацетонитрила, об. %: 20(0-3 мин), 17 (3-7 мин), 40 (7-10 мин) и 20 (10-15 мин); длина волны детектирования 280 нм. Условия определения сульфаниламидов и амфениколов: температура термостата колонки 30°С; подвижная фаза 20 мМ ацетат натрия (рН 5, доводили СН3СООН); содержание ацетонитрила, об. %: 15 (0-5 мин), 5 (5-7 мин), 10 (7-10 мин), 25 (10-15 мин), 40 (15-17), 15 (17-19), 10 (19-25);
длина волны детектирования 280 нм для сульфаниламидов и 228 нм для амфениколов. В обоих случаях расход подвижной фазы 1.0 мл/мин, объем вводимой пробы 20 мкл.
Продолжительность процедуры пробоподго-товки 30—40 мин. Для характеристики эффективности пробоподготовки рассчитывали степень извлечения (R) по формуле:
с V
R = ^ х 100, с V
í-or o
где ск и со — концентрации аналита в конечном анализируемом растворе-концентрате и начальная концентрация аналита в исходной пробе, Ук и Уо — объемы концентрата и пробы соответственно.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Фторхинолоны, хинолоны и хлорамфинекол имеют кислотный характер (табл. 2), поэтому в подвижную фазу вводили фосфорную кислоту до рН 2.2 и разделение проводили в присутствии мицелл 1-гептансульфоната натрия. Варьировали концентрации ацетонитрила, ПАВ и создавали градиент для лучшего разделения хинолонов и ХЛФ. На рис. 1 представлена хроматограмма смеси шести хинолонов и ХЛФ, полученная в оптимальных условиях при длине волны детектирования 280 нм. В данных условиях не удалось полностью разделить пары данофлоксацин-ломефлоксацин, оксоли-новая кислота-хлорамфеникол.
Таблица 2. Исследуемые антибиот
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.