УДК 577.352.4
ПРОДОЛЬНЫЕ ПРОФИЛИ pH ВАКУОЛЯРНОГО СОКА В ПЕРФУЗИРУЕМЫХ КЛЕТКАХ ХАРОВОЙ ВОДОРОСЛИ
© 2012 г. А. В. Алова, А. А. Булычев*, А. А. Черкашин
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119991, Москва;
*электронная почта: bulychev@biophys.msu.ru Поступила в редакцию 26.09.2011 г.
В освещенных харовых водорослях активности ионных насосов и Н+-проводящих каналов плазма-леммы распределены неравномерно по длине междоузлий, что проявляется в сдвигах pH до 3.5 единиц между разными участками у поверхности клетки. Пространственное варьирование свойств цитоплазмы определяет разную активность фотосинтеза в различных участках клетки и может сказываться на активности Н+-транспортирующих систем тонопласта. Для выявления возможной пространственной неоднородности клеточного сока по длине междоузлия проведены микроэлектродные измерения pH в вакуоле Chara corallina при плавном вытеснении клеточного сока искусственной средой в режиме вакуолярной перфузии. В качестве маркера поступления замещающей среды в зону измерения использовали флуоресцентный индикатор флуоресцеин, добавляемый в перфузионный раствор. У клеток, адаптированных к освещению, наблюдали неоднородные продольные профили pH вакуолярного сока с перепадами до 2—2.5 единиц pH. У адаптированных к темноте клеток сдвиги pH в продольных профилях не превышали 0.5 единиц pH. Выявление значительных перепадов pH в пределах вакуоли одной клетки указывает на возможность неоднородного распределения активности Н+-транспортирующих систем тонопласта в разных участках освещенной клетки.
Ключевые слова: Chara corallina, светозависимые пространственные структуры, транспорт протонов, тонопласт, вакуоль, внутриклеточная перфузия, профиль pH.
Харовые водоросли, филогенетически близкие высшим растениям, способны формировать на свету обособленные области (пространственные структуры), отличающиеся по активности фотосинтеза и электрохимическим градиентам протонов в хлоропластах и на плазмалемме [1, 2]. Светозависимая организация клеточных процессов приводит к неравномерному распределению Н+-насосов и ионных каналов плазмалеммы по длине клетки, что проявляется в неоднородном продольном профиле рН в тонком слое среды у поверхности клетки (рН0) [3]. В зонах активного выведения протонов рН0 опускается до уровня ~6.5, более низкого, чем рН в объеме раствора, а в зонах пассивной утечки Н+ (ОН-) рН0 возрастает до значений ~10.0 [4]. Хлоропластам "щелочных участков" клетки свойственны повышенный градиент рН в тилакоидах и высокий уровень тепловых потерь поглощенной энергии, а также низкая скорость фотосинтетического потока электронов [1, 2].
Пространственная неоднородность фотосинтетической активности и потоков Н+ на плазматической мембране указывает на возможные различия в уровнях рН цитоплазмы между разными участками клетки, что может сказаться на работе
транспортных систем тонопласта и распределении Н+ в клеточном (вакуолярном) соке по длине интернодальной клетки. Клеточный сок растений обладает слабокислой реакцией вследствие активной накачки Н+ из цитоплазмы в вакуоль при участии Н+-АТР-азы и Н+-пирофосфатазы тонопласта [5, 6]. Высокая концентрация Н+ в вакуоле и электрохимический градиент протонов на тонопласте служат источником энергии для запасания в вакуоле углеводов, которые поступают через тонопласт в обмен на выведение Н+. Кроме того, кислая среда клеточного сока создает оптимальные условия для активности вакуолярных ферментов. Имеющиеся сведения о рН клеточного сока получены без учета возможного образования пространственных структур в растительной клетке. Вместе с тем известно, что уровень рН в вакуолях весьма лабилен: его величина меняется при освещении [7-9], солевом стрессе [10], анок-сии [11, 12] и, возможно, при других воздействиях. В связи с этим представляется важным вопрос о распределении рН клеточного сока в междоузлиях харовых водорослей в условиях формирования пространственных структур при длительном освещении.
Продольные профили pHo у поверхности клеток Chara измеряют методом сканирования, перемещая клетку относительно неподвижного pH микроэлектрода [13]. Однако такой метод непригоден для измерения профиля pH в замкнутом ва-куолярном пространстве, ограничивающем цитоплазму с ее внутренней стороны. Вакуоль интер-нодальных клеток можно рассматривать как капиллярный столб жидкости, длина которого достигает 10 см, а объем составляет около 90% от общего объема клетки. Один из возможных, не опробованных пока подходов к измерению продольного профиля pH клеточного сока состоит в сочетании метода внутриклеточной перфузии [14] с микроэлектродной регистрацией pH. Для выполнения этой задачи необходимо ввести pH микроэлектрод внутрь вакуоли и плавно вытеснять клеточный сок искусственной средой через один из отрезанных концов клетки. При этом клеточный сок смещается в виде капиллярного столба в направлении другого срезанного конца междоузлия и протекает мимо точечного датчика pH. Таким образом, регистрируя показания pH микроэлектрода в ходе перфузии, можно получить профиль распределения pH клеточного сока по длине междоузлия и выяснить, является ли этот профиль светозависимым, подобно профилю pH, измеряемому на внешней стороне от слоя цитоплазмы.
В связи с этим цель данной работы состояла в измерении продольных профилей вакуолярного pH в междоузлиях Chara с помощью внутриклеточных pH-чувствительных микроэлектродов и метода внутриклеточной перфузии. В перфузион-ный раствор вносили флуоресцентный маркер, что позволяло отмечать момент прохождения фронта искусственной среды через зону измерения по возрастанию флуоресценции, измеряемой с помощью микрофлуориметра. Результаты работы свидетельствуют о неравномерном распределении pH вакуолярного сока в условиях внутриклеточной перфузии освещенных клеток. Природа неоднородного распределения pH в вакуоле освещенных перфузируемых клеток остается пока нераскрытой. Вместе с тем, полученные данные указывают на высокую лабильность концентрации Н+ в пределах вакуоли перфузируемых одиночных междоузлий, в результате чего участки с высокой кислотностью вакуолярного сока чередуются с участками, имеющими щелочную реакцию.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Водоросли Chara corallina выращивали в лаборатории при рассеянном дневном освещении и комнатной температуре. Клетки междоузлий длиной 5—10 см и диаметром 0.9—1 мм отрезали от основной оси таллома водоросли и помещали в
искусственную прудовую воду, содержащую 0.1 мМ KCl, 1.0 мМ NaCl и 0.1 мМ CaCl2. В среду вносили около 0.2 мМ NaHCO3 для доведения pH до 7.0—7.2. Для отбора клеток, образующих щелочные и кислые зоны, использовали pH-инди-каторный краситель феноловый красный.
Перед опытом одиночную интернодальную клетку Chara укрепляли в прозрачной пятисекци-онной камере из оргстекла; конструкция камеры была аналогична описанной в работе [15]. Центральный и боковые отсеки сначала заполняли искусственной прудовой водой; два промежуточных воздушных отсека предотвращали смешивание растворов в ходе опыта. Центральный отсек ограничивал участок междоузлия длиной 3 мм, размеры примыкающих осушенных участков составляли 7 мм, толщина перегородок между отсеками составляла 1 мм. Длина сегмента клетки, выступающего в донорный отсек с перфузион-ным раствором — 25—30 мм. Камеру размещали на столике инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 25-CFL (Carl Zeiss, Германия). По центру камеры в вакуоль клетки вводили рН-микроэлектрод, используя микроманипулятор из комплекта КМ-2. Эту операцию выполняли при нормальном тургорном давлении клетки до момента снятия тургора перед началом перфузии. На этом же участке клетки измеряли флуоресценцию маркерного красителя флуоресцеина, добавляемого в перфузионный раствор. Появление флуоресценции красителя служило показателем продвижения границы "клеточный сок—замещающий раствор" от срезанного торца клетки до места введения микроэлектрода. Источником освещения целой клетки до начала перфузии служила галогенная лампа накаливания, смонтированная в верхнем осветителе микроскопа. Свет попадал на объект, проходя через синий светофильтр СЗС-22. Максимальная плотность потока квантов составляла 100 мкмоль/(м2 • с).
Для измерения pH вакуолярного сока (рНвак) использовали сурьмяные микроэлектроды, изготовленные из стеклянных капилляров (пирекс) с расплавом сурьмы (диаметр рабочей торцевой части около 20 мкм). При измерениях pH^ на целой клетке pH-микроэлектрод размещали в центре вакуоли; с противоположной стороны клетки в тот же участок вакуоли вводили капиллярный микроэлектрод, соединенный с хлорсеребряным электродом сравнения. При измерениях pH^ в режиме перфузии электрод сравнения находился в одном из боковых отсеков камеры и контактировал с вакуолью через отрезанный торец клетки. Разность электрических потенциалов между датчиком pH^ и хлорсеребряным электродом сравнения измеряли электрометрическим усилителем VAJ-51 (Германия) с входным сопротивлением 1015 Ом. Сигнал с выхода усилителя оцифровывали АЦП/ЦАП преобразователем PCI-6024E (Na-
tional Instruments, США) и регистрировали с помощью программы WinWCP (Strathclyde Electro-physiology Software). Показания потенциала pH-микроэлектрода калибровали по стандартным буферным растворам (Orion). Калибровочные кривые использовали для расчета pH. Крутизна электродной функции рН-микроэлектро-дов составляла 55—58 мВ.
Момент прохождения фронта перфузионной среды, содержащей 100 мкМ флуоресцеин, через область измерения рНвак выявляли по возрастанию флуоресценции исследуемого участка клетки в зеленой области спектра. Ход световых лучей в микроскопе был аналогичен ходу лучей при измерениях флуоресценции хлорофилла системой Microscopy-PAM [16]. Источником света служил светодиод с излучением в зеленой области спектра. Для разделения света возбуждения и флуоресценции использовали спектральный куб с ди-хроичным зеркалом, фильтром возбуждения, пропускающим лучи в области 480—510 нм, и барьерным фильтром с пропусканием в области 520—570 нм. Использованный полосовой светофильтр поглощал собственную флуоресце
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.