ЛЕСОВЕДЕНИЕ, 2015, № 1, с. 27-35
_ ОРИГИНАЛЬНЫЕ _
СТАТЬИ
УДК 630*161.6: 582.475.2: 631.532
ПРОДУКТИВНОСТЬ ЭМБРИОГЕННЫХ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ И ИХ СОМАКЛОНАЛЬНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ У ЛИСТВЕННИЦЫ СИБИРСКОЙ IN VITRO
© 2015 г. И. Н. Третьякова, А. С. Иваницкая, М. Э. Пак
Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН 660036 Красноярск, Академгородок, 50/28 E-mail:culture@ksc.krasn.ru Поступила в редакцию 21.03.2014 г.
Проведено фенотипическое и цитоэмбриологическое изучение эмбриогенных культур Larix sibirica в зависимости от продолжительности культивирования. Полученные пролиферирующие клеточные линии лиственницы отличались разной эмбриогенной продуктивностью: содержанием и размером соматических зародышей, способностью их вызревать и прорастать, а также образовывать жизнеспособные сеянцы. Предполагается, что сомаклональная изменчивость, наблюдаемая в пролиферирующих клеточных линиях, остается нереализованной в процессе завершения соматического эмбриогенеза и получения клонированных сеянцев.
Лиственница сибирская, соматический эмбриогенез, клеточные линии, продуктивность, сомаклональная изменчивость.
За последние 28 лет с момента открытия соматического эмбриогенеза у представителя голосеменных растений - Picea glauca [16, 23] накоплен определенный фактический материал по изучению морфологических, физиологических, гистологических и молекулярных особенностей формирования соматических зародышей у видов семейства Pinaceae [10, 15, 26, 29, 31, 39, 43 и др.]. В 2010 г. в Южной Корее, а затем в 2012 г. в Чехии проведены конференции, посвященные достижениям в области изучения соматического эмбриогенеза у древесных видов и использованию данной технологии для выращивания будущих лесов, что легло в основу реализации селекционной программы клональ-ного лесоводства, широко используемой за рубежом [19, 31, 38].
Среди хвойных представители рода Larix являются наиболее распространенными лесообразую-щими древесными видами на территории России [2, 3]. Занимая обширный ареал, виды рода Larix обладают чрезвычайно высокой пластичностью вегетативных и генеративных органов, что отличает лиственницу от других представителей семейства Pinaceae [11].
Вместе с тем виды лиственницы, произрастающие в России, особенно в Сибири, характе-
ризуются слабыми урожаями, что проявляется в низком качестве семян и даже полном отсутствии их в неурожайные годы [3, 5], а также повреждением генеративных органов энтомовредителя-ми. Особенно сильное влияние на урожайность лиственницы оказывает лиственничная почковая галлица, при поражении которой вегетативные и генеративные почки превращаются в галлы и урожай лиственничных лесов падает. В насаждениях лиственницы редко (0.5%) встречаются деревья, устойчивые к лиственничной почковой галлице [1].
Способ микроклонального размножения видов Larix (L. decidua, L. kaempherri) через соматический эмбриогенез широко используется в плантационном лесовыращивании в Европе [29, 31]. Биотехнология соматического эмбриогенеза для видов лиственницы, произрастающих на территории Сибири (Larix sibirica и L. sukaszewii), была разработана нами в 2011 г. [7]. В полученных клеточных линиях Larix sibirica и L. sukaszewii происходило массовое образование соматических зародышей [8, 10]. Однако остается неясным, как долго эмбриогенные клеточные линии Larix sibirica и L. sukaszewii сохраняют свою активность в процессе культивирования и происходят ли в них какие-либо изменения.
В настоящей работе мы излагаем результаты изучения качества полученных эмбриогенных культур Larix sibirica в зависимости от продолжительности культивирования: продуктивность и возможную сомаклональную изменчивость на морфологическом и цитоэмбриологических уровнях.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДИКА
Объектами исследования служили 200 деревьев Larix sibirica, произрастающие в дендрарии Института леса им. Сукачева СО РАН, экспериментальном хозяйстве "Погорельский бор" и лиственничниках Республики Хакасия, из которых пять деревьев оказались устойчивыми к лиственничной почковой галлице Dasyneura Ьп^ Б. Lw. Возраст деревьев составлял 45-60 лет.
Семена опытных деревьев стерилизовали 5%-ным спиртовым раствором. После стерилизации в условиях ламинар-бокса из мегагамето-фитов извлекали зародыши и помещали на питательную среду. Общее число эксплантов с одного дерева составляло 40-100 шт.
Индукция эмбриогенного каллуса
Для инициации соматического эмбриогенеза из зиготических зародышей лиственницы использовали базовую среду АИ [7] с добавлением мезоинозита (0.1 г л-1), аскорбиновой кислоты (0.4 г л-1), гидролизата казеина (1 г л-1), L-глу-тамина (0.5 г л-1), сахарозы (30 г л-1) и агара (7 г л-1). В качестве регуляторов роста применяли 2.4-Д (2 мг л-1) и БАП (1 мг л-1). Водородный показатель среды приводили к 5.8 до автоклави-рования. В каждой чашке Петри культивировали по 10 зародышей на 20 мл индукционной среды в темноте при 24 ± 1°С.
Пролиферация эмбрионально-суспензорной массы (ЭМС)
Для пролиферации полученной ЭМС применяли базовую среду АИ, содержащую 2.4-Д (2 мг л-1), БАП (0.5 мг л-1) и сахарозу (20 г л-1). Культуры инкубировали в темноте при температуре 24 ± 1°С. Пересадку на свежую питательную среду проводили каждые 14 дней.
Предсозревание соматических зародышей
Через семь дней после субкультивирования на пролиферационной среде кусочки активно растущей ЭСМ весом 100-300 мг переносили на безгормональную базовую (АИ) среду с активированным углем (10 г л-1) и повышенным содержанием сахарозы (34 г л-1) для остановки пролиферации и перехода соматических зародышей к созреванию. Экспланты культивировали на свету малой интенсивности (10 мкмоль м-2 с-1).
Созревание соматических зародышей
Эксперименты по созреванию соматических зародышей лиственницы сибирской выполняли на базовой среде АИ, содержащей сахарозу (40 г л-1), абсцизовую кислоту (АБК) (40 мкмоль), индолил-масляную кислоту (ИМК) (1 мкмоль) и полиэтиленгликоль (ПЭГ) (10%). В качестве же-лирующего агента использовали Gelrite (4 г л-1). Культивирование осуществляли на свету малой интенсивности (20 мкмоль м-2 с-1) при 16-часовом фотопериоде, при 24 ± 1°С. Растительные регуляторы роста (АБК и ИМК) и L-глутамин стерилизовали фильтрованием и добавляли в охлажденную питательную среду после автокла-вирования.
Прорастание соматических зародышей
Для прорастания соматических зародышей использовали базовую питательную среду АИ, свободную от растительных регуляторов роста. Соматические зародыши считали проросшими при появлении корешка. Проростки (после 5 недель периода прорастания) переносили в стеклянные сосуды, содержащие стерильный почвенный субстрат (песок : вемикулит : торф = 1 : 1 : 1), увлажненный 0.5%-ным маточным раствором солей (среда АИ с 0.25%-ным содержанием). Культивирование осуществляли на свету при 24°С.
Цитологический анализ
Для проведения цитологического анализа использовали давленые препараты. Экспланты помещали на предметное стекло и 1-2 минуты выдерживали в красителе (сафранин с добавлением метиленового синего). Далее добавляли глицерин и накрывали препарат покровным стеклом.
Продуктивность эмбриогенных клеточных линий оценивали, подсчитывая число соматических зародышей в 1 г пролиферирующей эмбриональ-но-суспензорной массе (ЭСМ) через неделю после пересадки.
Просмотр микроскопических образцов осуществляли на микроскопе "МИКМЕД-6". В каждом образце измеряли 100-150 соматических зародышей. Фенотипы соматических зародышей определяли при помощи бинокуляра. Учитывали степень развития доменов зародыша (корень, гипокотиль, апикальная меристема, семядоли).
Статистическую обработку данных проводили по стандартным методикам [13] при помощи программы Microsoft Excel и Statistica 6.0 (1999) [41]. Для оценки достоверности полученных данных использовали однофакторный дисперсионный анализ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Эмбриогенный потенциал
Из эксплантов 200 деревьев лиственницы сибирской только у одного дерева-донора (№ А4) из незрелых зиготических зародышей от свободного опыления в 2008 г. была получена пролифе-рирующая эмбриогенная клеточная линия (Кл). В последующие годы (2009-2012 гг.) от этого же генотипа было получено еще восемь Кл, из них семь в результате свободного опыления и одна (Кл5) в результате контролируемого опыления генотипа А4 пыльцой L. sukaszewii [8]. Полученные Кл разного возраста отличались между собой по жизнеспособности, пролиферативной активности, по числу соматических зародышей, их размерам, способности вызревать и прорастать. В молодых Кл (возраст 1 год) число соматических зародышей в 1 г сырой ЭМС в среднем колебалось от 2040 (Кл7) до 7655 (Кл9), а у Кл10 это число достигало 11103 зародышей. Большинство эмбрио-генных каллусов сохраняли жизнеспособность и пролиферативную активность в течение 2-4 лет. Число соматических зародышей в 1 г эмбриоген-ного каллуса оставалось высоким (табл. 1). Спад пролиферативной активности и отмирание каллуса происходили только у Кл 3 на третий год и Кл1 на пятый год культивирования.
Размеры соматических зародышей в проли-ферирующих Кл также значительно варьировали (рис. 1). Наиболее мелкие зародыши были отмечены у гибридной Кл5 (глобула 90.6 мкм, суспензор 126.4 мкм), наиболее крупные у Кл6 (глобула 282 мкм, суспензор 1124 мкм) (табл. 1). Выявилось, что различия по диаметру глобулы зародыша Кл5 с Кл2, 6, 7 оказались достоверными
< 0.05). Достоверные различия по всем Кл были обнаружены по длине суспензора < 0.05).
Вызревание соматических зародышей на среде АИ с АБК происходило в течение 45 суток. Число вызревших соматических зародышей значительно уменьшилось: так, у Кл6 вызревало только 12 шт. соматических зародышей, у других Кл намного больше, а у Кл 4 составляло 1221 шт. Мелкие соматические зародыши Кл5 на среде с АБК вообще не вызревали.
В процессе вызревания наблюдались разного рода нарушения в морфогенезе зародыша. Наименьшее число аномальных зародышей было отмечено у Кл4, у которой формировались в основном нормальные по фенотипу зародыши (83.3%) (табл. 2). У других Кл наблюдались многочисленные отклонения в морфогенезе разных доменов зародыша и цитокинез. Наибольшее
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.