МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 6, с. 1067-1075
ПРИКЛАДНАЯ МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 579.6,577.27
ПРОДУКЦИЯ Fab-ФРАГМЕНТА ДНК-ГИДРОЛИЗУЮЩЕГО АНТИТЕЛА BV04-01 В МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖАХ Pichia pastoris
© 2004 г. А. В. Козырь*, Т. В. Бобик, А. Н. Игнатова, А. В. Колесников
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, Москва, 117997 Поступила в редакцию 14.01.2004 г.
Разработана эффективная система синтеза рекомбинантного Fab-фрагмента каталитического ДНК-гидролизующего антитела BV04-01 в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris. Для стабилизации цепей в составе Fab-фрагмента к их С-концу присоединяли димеризующиеся полипептиды Jun и Fos, входящие в состав "лейциновой молнии". Концентрация функционально активного рекомбинантного Fab-фрагмента антитела в культуральной жидкости достигает 3 мг на литр культуры. Каталитическая эффективность полученного Fab-фрагмента в отношении гидролиза суперскручен-ной ДНК составляет 1.8 х 106 M-1 мин-1.
Ключевые слова: продукция рекомбинантных антител, каталитические антитела, Fab-фрагмент, Pichia pastoris.
PRODUCTION OF DNA-HYDROLYZING ANTIBODY BV04-01 Fab FRAGMENT IN METY-LOTROPHIC YEAST Pichia pastoris, by Л. V. Kozyr*, T. V. Bobik, A. N. Ignatova, A. V. Kolesnikov (Shemya-kin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS, Moscow, 117997; *e-mail: akoz@mail.ibch.ru). Efficient system for producing the recombinant Fab of DNA-hydrolyzing antibody BV04-01 in metylotrophic yeast Pichia pastoris was developed. Addition of peptides encompassing the Jun-Fos leucine zipper at the C-termini of the antibody chains facilitated the in vivo assembling of the Fab. The yield of secreted functionally active BV04-01 Fab was about 3 mg/L. Catalytic efficiency of supercoiled DNA hydrolysis by the Fab obtained was 1.8 х 106 M-1 min-1.
Получение рекомбинантных антител является одной из наиболее актуальных для молекулярной иммунологии экспериментальных задач, которая имеет большое фундаментальное и практическое значение. Разработано много систем экспрессии антител, среди которых наиболее часто используют экспрессионные системы на базе кишечной палочки Escherichia coli [1], однако задача получения более эффективных систем пока не решена. В качестве вариантов предлагали различные системы для получения рекомбинантных антител в других бактериальных клетках [2], дрожжах [3, 4], растениях [5], в клетках насекомых [6] и млекопитающих [7]. Однако, к сожалению, ни одна из них не является универсальной и не гарантирует высокого уровня продукции и функциональной активности каждого конкретного антитела. Так, система получения рекомбинантных белков в E. coli, несмотря на техническую простоту, имеет особенности, ограничивающие ее возможности. Для E. coli характерна иная частота встречае-
Принятые сокращения: ПЦР - полимеразная цепная реакция, ПААГ - полиакриламидный гель, IgG - иммуноглобулин G.
* Эл. почта: akoz@mail.ibch.ru
мости кодонов аминокислот, чем для эукариот, большая зависимость уровня продукции белка от аминокислотного состава цепей антител, низкая эффективность экспрессии полицистронных конструкций. В структуре одноцепоченого миниан-титела (single chain antibody, scFv) вариабельные фрагменты цепей объединены гибкой линкерной последовательностью, что препятствует диссоциации субъединиц антитела [8], однако именно ми-ниантитела продуцируются в E. coli, в среднем, более эффективно, чем гетеродимерные Fab-фрагменты, состоящие из двух полипептидных цепей. Основной причиной неудач при получении Fab-фрагмента, помимо упомянутых различий в уровне экспрессии отдельных цепей антитела, является низкий уровень образования стабильного гетеродимера в периплазме E. coli [9].
К сожалению, одноцепочечные антитела не всегда сохраняют активность нативного антитела, часто оказываются нерастворимыми, и синтезированный белок необходимо подвергать ре-фолдингу [10, 11]. На этом этапе далеко не всегда обеспечивается корректная укладка белка, необходимая для восстановления природной активности антитела.
В 1993 г. [12] предложена система экспрессии на основе метилотрофных дрожжей Pichia pastoris, которая позволяет получать как секретиру-емые, так и внутриклеточные рекомбинантные белки [13-15]. Методология создания продуцентов в P. pastoris, основанная на включении реком-бинантных конструкций в геном дрожжей, дает возможность синтезировать белки, состоящие из нескольких субъединиц. Это свойство экспресси-онной системы P. pastoris с успехом использовано для получения в активной форме разнообразных многосубъединичных белков [16-19].
В 1999 г. предпринята попытка получить в системе P. pastoris интактные антитела к диоксину [20], однако в этих опытах только небольшой процент тяжелых и легких цепей участвует в формировании активного тетрамера. При синтезе гетеродимера Fab-фрагмента антител, специфичного к атразину, эффективность сборки цепей больше (до 30%) [21]. При ферментации выход этих антител к поверхностному антигену вируса гепатита В достигал десятков милиграмм на литр [21, 22], что на несколько порядков превышает уровень экспрессии в E. coli и обеспечивает возможность структурных исследований антител [23] и их терапевтического применения. Недавно созданы штаммы дрожжей, в которых частично или полностью воспроизводится этап гликозилирования белков человека (см. [24]). Это увеличивает время жизни рекомбинантных антител в кровотоке и улучшает их терапевтическое действие.
При изучении каталитических антител (абзи-мов) используют технологии получения рекомбинантных антител с применением различных вариантов мутагенеза in vitro [25]. Некоторые из абзимов получены с помощью отбора из комбинаторных библиотек и никогда не существовали в виде полноразмерных молекул антител [26]. Развитие методов химической селекции абзимов из комбинаторных библиотек антител привело к тому, что доля абзимов, полученных таким путем, возрастает. В связи с этим, проблема увеличения выхода функционально активных рекомбинантных форм антител особенно актуальна. Для этой цели система E. coli непригодна, поскольку многие из этих антител токсичны для бактериальной клетки. В случае P. pastoris частичная компартментализа-ция продуктов помогает изолировать каталитическую активность абзимов от жизненно важных компонентов клетки. Высокий уровень синтеза обеспечивает реальные потребности структурно-функционального анализа мутантных вариантов антител. Наконец, в случае использования P. pastoris существенно легче проводить очистку ре-комбинантного продукта, выделяемого во внеклеточную среду, поскольку доля других, секре-тируемых этим организмом, белков невелика.
В данной работе мы сконструировали систему для синтеза в P. pastoris рекомбинантного Fab-фрагмента ДНК-гидролизующего антитела BV04-01, которое является, на данный момент, единственным, достаточно хорошо изученным моноклональ-ным антителом с эндонуклеазной активностью [27]. При разработке экспрессионной системы особое внимание было уделено проблеме стабилизации цепей в составе Fab-фрагмента, а также изучению каталитической активности Fab-фрагмента и уровеня его димеризации.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Клетки гибридомы mrl4 были любезно предоставлены А. Теофилополусом, (A.N. Theofilopou-los, Институт Скриппса, США) мРНК выделяли из крови пациентов с хроническим лимфолейкозом, предоставленной сотрудниками Всероссийского гематологического научного центра РАМН.
Использовали дрожжевые векторы pAO815 и pPICZaB, штамм P. pastoris GS115, и дрожжевые среды ("Invitrogen", США), бактериальные среды фирмы "BD Biosciences" (США), соли и реактивы фирм "Sigma" (США) и "Merck" (Германия), ферменты для генно-инженерных работ и хромато-графические сорбенты MonoQ и Sephadex G-25 фирмы "Amersham Pharmacia" (Великобритания) и Talon ("Clontech"), термостабильную полимера-зу Pfu фирмы "Stratagene" (США), конъюгаты мо-ноклональных антител с пероксидазой хрена фирмы "Sigma" (США).
Олигонуклеотиды, использованные в работе, были синтезированы фирмой "Синтол" (Москва), изотоп [а-32Р]дезоксиАТР синтезирован в НПО "Изотоп" (Обнинск).
В работе использовали стандартные генно-инженерные методы [28]. Последовательности генов вариабельного домена и домена CH1 тяжелой а также вариабельного домена и домена Ск легкой цепей антитела MRL4 [29] получали с помощью обратной транскрипции с мРНК, выделенной из клеток гибридомы mrl4, затем амплифицировали в ПЦР с использованием праймеров, специфичных к 3'- и 5'-концам данных фрагментов ДНК, и клонировали в ¿maI-сайте плазмиды pBluescriptlI SK-("Stratagene"). Последовательности, соответствующие вариабельным доменам тяжелой и легкой цепей антитела BV04-01 [30], получали из последовательностей генов антитела MRL4, используя метод обратимого ПЦР-мутагенеза [31], и затем амплифицировали с праймеров, содержащих сайты XhoI и NotI для клонирования в векторе для экспрессии в P. pastoris. С помощью метода обратимого ПЦР-мутагенеза удаляли сайты BamHI и XhoI в CH1 тяжелой цепи и BglII в VK, которые мешают следующим этапам сборки экспрессионной конструкции. Использовали следующие последо-
вательности праймеров: XholHch: 5' gta tga ctc gag aaa aga gag gct gaa gct gag gtg cag ctt gtt gag; XholLch: 5' gta tga ctc gag aaa aga gag gct gaa gct gat gtt gtg atg acc caa; NotlHch: 5' сй agt agc ggc cgc aac tgt ctt gtc cac ctt ggt gtt; NotILch: 5' сй agt agc ggc cgc aca ctc tcc cct gtt gaa gct c.
Последовательности, соответствующие полипептидам Jun и Fos, получали путем обратной транскипции мРНК крови человека и амплифицировали с использованием специфических праймеров, содержащих сайты разрезания эндонукле-азами NotI и EagI (Jun) или NotI и XbaI (Fos). Прай-мер, соответствующий С-концу полипептида Fos, содержит два стоп-кодона. Использовали следующие последовательности праймеров: JunForNotI: 5' ttt gtc gac gcg gcc gca tgc ggt ggt cgg atc gcc cgg ctg gag gaa aaa g; JunRevEagI: 5' aat tta ttt c ggc cgt acc gca acc acc gtg gtt cat gac ttt ctg ttt aa; FosForNotI: 5' ttt gcg gcc gca tgc ggt ggt ctg act gat aca ctc gaa gcg ga; FosRevXbaI: 5' ttt ctc gag tct ag
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.