МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 4, с. 411-417
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 582.282.23.577.[152+124/5]
ПРОДУКЦИЯ КСИЛИТА И ЭТАНОЛА, АКТИВНОСТЬ КЛЮЧЕВЫХ ФЕРМЕНТОВ КАТАБОЛИЗМА D-КСИЛОЗЫ
у мутантов рлсиубоьем тштртьиз
© 2015 г. О. И. Болотникова*, 1, Е. П. Трушникова**, Н. П. Михайлова**, А. И. Гинак**
*Петрозаводский государственный университет **Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)
Поступила в редакцию 09.01.2014 г.
Изучена продукция ксилита и этанола, а также активность ключевых ферментов катаболизма Б-ксилозы у мутантов дрожжей Раску8о1вп tаппоркйт с измененным ростом на Б-ксилозе, ксилите, этаноле или Б-глюкозе в качестве единственного источника углерода. Угнетение активности кси-лозоредуктазы с преимущественным сродством к НАДФН и ксилитдегидрогеназы до 4.40 и 4.80 мкмоль мг-1 мин-1 соответственно индуцировало накопление 0.25 г ксилита на г потребленной Б-ксилозы. Наибольшая активность НАДН/НАДФН-ксилозоредуктазы и ксилитдегидрогеназы (6.00-6.80 и 6.80-8.40 мкмоль мг-1 мин-1) зафиксирована у штаммов, продуцирующих 0.24-0.26 г этанола на г Б-ксилозы. Обсуждается использование мутантов Ра. tаппоркИт для анализа регуляции катаболизма Б-ксилозы.
Ключевые слова: D-ксилоза, ксилит, этанол, ксилозоредуктаза, ксилитдегидрогеназа, дрожжи Pach-ysolen tannophilus.
DOI: 10.7868/S0026365615040047
Установлено, что направленность распада D-ксилозы у ксилозоассимилирующих дрожжей зависит от интенсивности аэрации. При дефиците кислорода (т.н. микроаэробиоз) их штаммы начинают продуцировать ксилит и этанол [1], соотношение которых тесно коррелирует с активностью ключевых ферментов ксилозоредуктазы и ксилитдегидрогеназы [2]. Несмотря на это, метаболические сдвиги, обусловливающие селективное накопление индивидуальных целевых продуктов микроаэробной ферментации D-ксилозы, до сих пор не ясны. Их выявлению препятствует слабая изученность жизненного цикла Candida intermedia, C. parapsilosis и C. silvanorum, образующих преимущественно ксилит [1], а также Pichia stipitis и C. shehatae, продуцирующих спирт [1], затруднявшая экспериментальную работу с данными видами.
Удобным инструментом для решения такой задачи могут стать штаммы Pachysolen tannophilus, условия стабилизации вегетативного роста, а также индукции полового процесса которых известны [3]. Однако коллекционные варианты этих дрожжей накапливают в сопоставимых количествах оба целевых продукта микроаэробной ферментации D-ксилозы [1]. Поэтому использование Pa. tannophilus для анализа метаболической регуляции об-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: bolot@onero.ru).
разования ксилита и этанола определяется возможностью селекции мутантов с нарушениями катаболизма Б-ксилозы. Такие штаммы, характеризующиеся измененной продукцией ксилита и этанола, уже выделяли ранее, используя специальные методы [4—7]. Аналогичным образом нами были получены мутанты на основе отселекти-рованного устойчивого гаплоидного штамма Ра. tannopkilus 22-У-1532 [8]. Вероятно, некоторые из них также способны к образованию индивидуальных продуктов микроаэробной ферментации Б-ксилозы.
Поэтому цель настоящей работы заключалась в анализе накопления ксилита и этанола мутантами Ра. tannopкilus 22-У-1532, а также оценке корреляции их уровня с активностью ксилозоредук-тазы и ксилитдегидрогеназы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектами исследования были 9 мутантов Ра. tannopкilus 22-У-1532, которые характеризовались измененным ростом на средах с Б-ксилозой, ксилитом, этанолом или Б-глюкозой в качестве единственного источника углерода (табл. 1), выделенные согласно [8]. Родительский гаплоидный штамм служил контролем. Его плоидность была доказана ранее с использованием целой се-
Таблица 1. Рост мутантов Ра. tаппоркйт на различных источниках углерода
№
штамма
Глюкоза*
Источник углерода
Ксилоза*
Ксилит
4 + + + + Glu±Xyl±XylOH±EtOH±
13 + + ± - Glu+Xyl+XylOH±EtOH-
228 + + + + Glu+Xyl+XylOH+EtOH+
390 + + ± - Glu+Xyl+XylOH±EtOH-
442 + + - + Glu+Xyl+XylOHEtOH+
497 + + - + Glu+Xyl+XylOHEtOH+
517 + + + ± Glu+Xyl+XylOH+EtOH±
664 + ± ± ± Glu+Xyl±XylOH±EtOH±
686 + + + ± Glu+Xyl+XylOH+EtOH±
К + + + + Glu+Xyl+XylOH+EtOH+
Этанол
Фенотип
Примечание. В качестве контроля использовали рост исходного штамма Ра. tannophilus 22-У-1532. Условные обозначения: + — активный, +— хороший, ± — слабый рост на селективной среде; — полное отсутствие роста на селективной среде. * — О-изомеры сахаров.
рии критериев [3, 9], а также подтверждена генетическими экспериментами [8].
Дрожжи выращивали на плотной среде JEPD с 2% D-ксилозы в качестве единственного источника углерода, 2% пептона, 0.5% дрожжевого экстракта и 2% агар-агара [9] при температуре 30°С в течение 2—14 сут. Микробиологический анализ мутантов проводили с помощью микроскопа Je-named variant (Германия) при увеличении окуляра и объектива х18 и х40, оценивая макроморфоло-гические (диаметр, цвет, форму, поверхность, консистенцию колоний), а также микроморфологические (размер, тип почкования, характер споруляции клеток) признаки [3].
Микроаэробную ферментацию осуществляли в 250 мл круглодонных колбах со 100 жидкой среды JEPD на термостатированной качалке при интенсивности перемешивания 100 об/мин, при 30 ± 2°С в течение 24 ч, дрожжи вносили из расчета 6.0 г сухой биомассы на л среды [1].
Методы биохимического анализа. Концентрацию редуцирующих сахаров определяли по Феллингу. Для количественного определения биомассы использовали спектрофотометр СФ-26 ("Ломо", СССР). Пробы культуры, взятые после окончания ферментации, колориметрировали против жидкой питательной среды JEPD при 620 нм. Этиловый спирт и ксилит определяли методом газовой хроматографии при условиях [1].
Бесклеточные экстракты получали, ресуспенди-руя дрожжевые клетки в 10 мМ калий-фосфатном буфере (рН 6.5), содержащем 1 мМ 2-меркаптоэта-нола, и разрушая клетки стеклянными шариками диаметром 0.4—0.5 мм на гомогенизаторе ("VOrtex", Германия) в течение 5 заходов по 1 мин с охлаждением в перерывах. Затем обломки клеток осаждали цен-
трифугированием (45000 об/мин, при 0°, 20 мин). Концентрацию белка в полученных экстрактах определяли по методу Лоури [10], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.
Белки бесклеточных экстрактов разделяли с помощью денатурирующего электрофореза в 15% полиакриламидном геле. Определение активности ксилозоредуктазы и ксилитдегидрогеназы в присутствии различных коферментов проводили непосредственно в геле с использованием тетра-золия фиолетового. Гели после электрофореза инкубировали при температуре 30°С в окрашивающем растворе следующего состава: 50 мМ трис-НС\ (рН 8.0); 0.2 мМ НАДФ+ или НАД+; 1 мМ ксилит; 0.3 мМ тетразолий фиолетовый; 0.01 мМ феназинметасульфат. Ход анализа соответствовал изложенному в статье Зверлова с соавторами [11].
Статистическую обработку полученных результатов проводили стандартными методами [12], используя критерий Стьюдента при уровне значимости, равном 0.05. Размеры выборок для каждого исследованного штамма, включая положительный и отрицательный контроли, составляли не менее 5 значений. Отклонения значений от среднего не превышали 5%.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Общая характеристика мутантов Ра. 1аппорЫ-
1т. В соответствии с классификацией Крегер Ван Рея, жизненный цикл исследуемых дрожжей относится к дипло-гаплонтному типу с преобладанием гаплофазы [9]. Ярко выраженный гомоталлизм (отсутствие определенного типа спаривания клеток, сложность разделения вегетативной и гене-
ПРОДУКЦИЯ КСИЛИТА И ЭТАНОЛА, АКТИВНОСТЬ КЛЮЧЕВЫХ ФЕРМЕНТОВ
413
ративной фаз жизненного цикла) часто осложняют экспериментальный анализ штаммов данного вида [13]. Поэтому мутанты с измененным ростом на Б-ксилозе, ксилите, этаноле или Б-глюкозе в качестве единственного источника углерода были выделены на основе отселектированного устойчивого гаплоида Ра. tannopкilus 22-У-1532. Однако индуцированные мутагеном изменения могли затрагивать не только структуру генов, участвующих в регуляции катаболизма Б-ксилозы, но также других, отвечающих за морфогенез дрожжей. Чтобы исключить внутрипопуляционную нестабильность (одновременное присутствие клеток, находящихся в гапло- и диплофазе) оценили морфологические характеристики мутантов Ра. tan-тркИш.
В большинстве случаев, их макроморфология хорошо соответствовала аналогичным параметрам контрольного гаплоида: его колонии диаметром 1.0 мм имели белый цвет, округлую форму и блестящую выпуклую поверхность. Слизистая консистенция колоний сохранялась в течение первых двух суток инкубирования на УЕРБ среде, а затем изменялась на маслообразную. Незначительные модификации этих признаков, выявленные у штаммов с измененным ростом на Б-кси-лозе, ксилите, этаноле или Б-глюкозе в качестве единственного источника углерода, отражает табл. 2.
Микроморфологические параметры мутантов, напротив, варьировали в достаточно широких пределах. Так, клетки исходного гаплоида имели размеры 1.5-4.5 х 2.0-6.5 мкм, характеризовались биполярным почкованием, они спорулиро-вали на 5-6 сут культивирования на УЕРБ. Колонии штаммов № 13, 497, 517 и 664 состояли из более мелких, а № 4 - значительно более крупных клеток. Сдвиг времени споруляции в пределах 1-2 сут зафиксировали у мутантов № 4, 517 и 686. Наконец, мультилатеральный тип почкования, не свойственный дрожжам Ра. tannopкilus [9], обнаружили у мутанта № 442, который не ассимилировал ксилит (табл. 1). Однако в пользу его гаплоидно-сти свидетельствовали характер роста колоний, форма, размер клеток, а также морфология аско-форов [3]. Появление упомянутых различий, вероятно, обуславловается плейотропным характером нарушений способности дрожжей ассимилировать Б-ксилозу, ксилит, этанол или Б-глюкозу в качестве единственного источника углерода, либо анеуплоидией индуцированных мутантов.
Таким образом, в работе экспериментально подтверждена внутрипопуляционная стабильность всех исследованных мутантных штаммов Ра. tannopкilus 22-У-1532. Их гаплоидность, делающая возможной фенотипическое проявление не только доминантных, но и рецессивных
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.