МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 5, с. 811-816
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.151.7
ПРОДУЦИРОВАНИЕ И СТАБИЛИЗАЦИЯ СВЯЗЫВАЮЩЕГО ИНТЕГРИН ЗВЕНА КОМПОНЕНТА 3 КОМПЛЕМЕНТА* © 2015 г. C. Y. Wu1, M. X. Liang1, Q. Chen*
State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University, and Collaborative Innovation Center for Biotherapy, Chengdu, 610041, P.R. China Поступила в редакцию 29.12.2014 г.
Принята в печать 04.03.2015 г.
Третий компонент комплемента, C3, играет центральную роль в системе врожденного иммунитета человека. Продукт протеолиза нативного C3, iC3b, представляет собой первичный лиганд рецепторов комплемента (CRs) CR3 и CR4. CR3 и CR4 — это интегрины семейства р2, и их связывание с iC3b способствует фагоцитозу. Каким образом iC3b связывается со своими рецепторами и передает сигналы внутрь клеток, не понятно. Для структурно-функциональных исследований взаимодействия между iC3b и его рецепторами CR3/CR4 выделен интегрин-связывающий фрагмент iC3b-MG3-4. Для его экспрессии в растворимой форме в Escherichia coli необходимо поддерживать низкую температуру. Очищенный белок MG3-4 в растворе находится в форме димера и легко образует агрегаты. Испытав различные агенты, мы выявили, что глицерин способен эффективно стабилизировать фрагмент MG3-4, предотвращая его агрегацию. Используя поверхностный плазмонный резонанс (SPR), мы подтвердили, что MG3-4 может связываться с доменом I — iC3b-связывающим доменом рецептора CR3. Таким образом, нам удалось продуцировать растворимую, стабильную и биологически активную форму интегрин-связывающего звена молекулы iC3b человека, пригодную для дальнейших исследований.
Ключевые слова: C3, интегрин, фагоцитоз, агрегация, белок-белковые взаимодействия.
PRODUCTION AND STABILIZATION OF AN INTEGRIN-BINDING MOIETY OF COMPLEMENT COMPONENT 3, by C. Y. Wu1, M. X. Liang1, Q. Chen* (State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University, and Collaborative Innovation Center for Biotherapy, Chengdu, 610041 P.R. China; *E-mail: qiang_chen@scu.edu.cn). The third component of complement, C3, plays a central role in human innate immunity. The subsequent proteolysis product of native C3, iC3b, is the primary ligand of complement receptors (CRs) CR3 and CR4. CR3 and CR4 are p2-family integrins, and their binding to iC3b contributes to phagocytosis. How iC3b binds to its receptors and transmits signals into the cells is not clear. To perform structural and functional studies on the interaction between iC3b and its receptors CR3/CR4, we isolated the integrin-binding fragment of iC3b, MG3-4. Low temperature is required for its soluble expression in Escherichia coli. Purified MG3-4 existed as a dimer in solution and was easy to aggregate. We tried different agents and found glycerol could efficiently stabilize the MG3-4 fragment to avoid aggregation. Using surface plasmon resonance (SPR) analysis, we confirmed MG3-4 could bind I domain, the iC3b-binding domain of CR3. Here, we report the successful production of a soluble, stable, and biologically active integrin-binding moiety of human iC3b for further studies.
Keywords: C3, integrin, phagocytosis, aggregation, protein-protein interaction. DOI: 10.7868/S0026898415050201
Система комплемента действует как главный эффектор гуморального звена иммунной системы человека для защиты хозяина от таких микроорганизмов как бактерии. Третий компонент комплемента, С3, и продукты его активации — это ключевые молекулы как активационного пути комплемента, так и процессов опсонизации чу-
# Текст представлен автором на английском языке. 1 Авторы внесли равнозначный вклад в эту работу.
* Эл. почта: qiang_chen@scu.edu.cn
жеродных частиц в ходе иммунного распознавания и фагоцитоза [1]. Молекула нативного С3 протеолитически активируется до С3Ь, а в результате последующего протеолиза С3Ь образуются молекулы Ю3Ь и С3с. Ю3Ь конвертируется в С3с при удалении тиоэфирного домена. Эти продукты активации представляют собой лиганды для 5 рецепторов ком-
племента (CR) [2], причем iC3b — первичный ли-ганд CR3 и CR4.
Рецепторы CR3 (aMß2, Mac-1, CD11bCD18) и CR4 (aXß2, p150/95, CD11c/CD18) - члены семейства ß2-интегринов; они относятся к важней-щим медиаторам комплементзависимого фагоцитоза [3]. Рецепторы CR3 и CR4 необходимы как для связывания iC3b, так и для распознавания и фагоцитоза патогенов и иммунных комплексов [4]. Расшифровка кристаллической структуры комплекса интегрин-iC3b позволила увидеть в деталях, каким образом эти два белка взаимодействуют между собой, и тем самым прояснить механизмы регуляции активации комплемента.
С целью облегчить процедуру кристаллизации часто используют не полноразмерный белок, а тот или иной его фрагмент. Согласно последним данным электронной микроскопии, интегрин aXß2 связывается с iC3b или C3c одним и тем же способом, а минимальные детерминанты взаимодействия интегрин—iC3b/C3c идентифицированы как домен I интегрина и фрагмент MG3-4 в составе iC3b/C3c [5]. Домен I интегрина хорошо изучен [6—12]. Нами исследована экспрессия, очистка и стабилизация фрагмента MG3-4 из iC3b человека. Выявлено, что растворимая форма экспрессируемого белка MG3-4 может быть получена при низких температурах. В растворе MG3-4 существует как димер. Фрагмент MG3-4 склонен к быстрой агрегации. В качестве стабилизаторов MG3-4 мы опробовали различные агенты и выявили, что глицерин эффективно повышает стабильность этого белка. Биологическая активность MG3-4 подтверждена с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Конструирование плазмид. кДНК интегрин-связывающего участка iC3b человека, MG3-4, ам-плифицировали с помощью ПЦР в плазмиде, кодирующей полноразмерный белок C3 человека, используя следующие праймеры:
5'-CATGCCATGGGCAGTTTCGAGGTCAT-3' и 5'-GTACTCGAGGTAGGGCAGAGCCTGCAT-3'.
Продукты ПЦР встроили в плазмиду pET-28b(+) ("Novagen") по сайтам рестрикции NcoI и XhoI (подчеркнуты) и получили экспрессионный конструкт MG3-4.
Экспрессия целевого белка и его растворимость.
Для экспрессии целевого белка использованы клетки Escherichia coli, штамм Rosetta ("Novagen"). Единичную колонию MG3-4 инокулировали в 20 мл среды LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина, и культивировали в шейкере при 37°C в течение ночи. Полученную ночную затравку использовали для инокуляции 1 л среды LB и культивировали
при 37°C на шейкере в течение 2—3 ч до достижения оптической плотности 0.7—0.9 при длине волны 600 нм (OD600). Для индукции бактериальной экпрессии в среду вводили изопропил-P-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) до конечной концентрации 0.4 мМ, и в тот же момент культуру клеток переносили на шейкер с температурой 18°C и оставляли на 18 ч. Клетки осаждали центрифугированием и ресуспендировали в буфере: 20 мМ Tris-HCl, pH 7.4, 250 мМ NaCl, 5 мМ ими-дазол (TN-буфер). Клетки хранили при —80°C.
Растворимость экспрессированного белка анализировали следующим образом. Клетки собирали, как описано выше, суспендировали в TN-бу-фере и лизировали ультразвуковой обработкой. Из полученного лизата отбирали 1-мл аликвоту и центрифугировали при 13000 об./мин в течение 20 мин. Осадок ресуспендировали в TN-буфере. Суперна-тант и осадок анализировали электрофорезом в SDS-PAG и оценивали распределение целевого белка в этих фракциях.
Очистка белка. Собранные клетки лизировали ультразвуковой обработкой. Лизат смешивали с намагниченными микрочастицами никеля Bea-verBeads™ IDA-Nickel ("Beaverbio", Китай), уравновешенными TN-буфером. Для удаления примесей микрочастицы промывали TN-буфером, содержащим 50 мМ имидазола, после чего целевой белок элюировали TN-буфером с 250 мМ имидазола, концентрировали до объема 0.5 мл, используя для этого систему фильтрации Amicon Ultra centrifugal filter ("Millipore"), и очищали гель-фильтрацией на колонке с Superdex 200 ("GE Healthcare"), уравновешенной HEPES-бу-фером (20 мМ HEPES, pH 7.5, со 100 мМ NaCl). Степень чистоты целевого белка оценивали электрофорезом в SDS-PAG.
Определение молекулярной массы. Молекулярную массу фрагмента MG3-4 в растворе оценивали методом гель-фильтрации/многоракурсного светорассеяния (size exclusion chromatography/ multi-angle light scattering, SEC/MALS; "Wyatt Technology Inc.", США). Образец белка (200 мкл с концентрацией 8 мг/мл) наносили на колонку с Superdex 200, уравновешенную HEPES-буфером. Молекулярную массу белка определяли по методике, предлагаемой производителем.
Стабильность белка. Стабильность белка оценивали методом гель-фильтрации. Образец белка (200 мкл) наносили на колонку с Superdex 200, уравновешенную HEPES-буфером. Растворимый агрегированный белок выходил в свободном объеме, а правильно свернутый белок MG3-4 задерживался на колонке и элюировался на 15.5 мл.
Поверхностный плазмонный резонанс (SPR). Мутант F302L с высокоаффинным доменом I aM предоставлен д-ром Yamei Yu. Связывание MG3-4 и F302L оценивали методом SPR на приборе Bia-
core 3000 ("GE Healthcare") при комнатной температуре. Белок F302L ковалентно иммобилизовали на поверхности сенсорного чипа CM5, используя набор Amine coupling kit BIAcore ("GE HealthCare"). Раствор очищенного белка MG3-4 в электродном буфере: 20 мМ Tris-HCl (pH 7.4), 150 мМ NaCl, 20 мМ MgCl2 - пропускали через сенсорный чип при скорости потока 10 мкл/мин. Поверхность чипа регенерировали раствором 2 М NaCl с 50 mM EDTA и 0.05% NP-40.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Дизайн и экспрессия конструкта
С помощью негативной электронной микроскопии было подтверждено связывание между интегрином aXß2 и iC3b/C3c [5]. Молекула iC3b состоит из C3c и тиоэфирного домена, связанного длинной гибкой петлей. Домен I интегрина aX взаимодействует со звеном C3c, которое расположено на интерфейсе доменов MG3 и MG4 [5] (рис. 1). В ходе исследования нами выделен фрагмент MG3-4. Границы взаимодействующего с интегрином фрагмента MG3-4 идентифицированы методом рентгеноструктурного анализа человеческого C3c (PDB ID: 2A74): начиная с SFEVTV.. и заканчивая ...TMQALP. кДНК MG3-4 амплифи-цировали и встраивали в экспрессионный
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.