МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 4, с. 610-616
ГЕНОМИКА. ^^^^^^^^^^^^^^ ТРАНСКРИПТОМИКА
УДК 577.21
ПРОФИЛЬ ЭКСПРЕССИИ ПРОМОТОРА ГЕНА р-1,3-ГЛЮКАНАЗЫ Arabidopsis thaliana В РАСТЕНИЯХ ТАБАКА#
© 2015 г. M. Jopcik, I. Matusikova, J. Moravcikova, D. Durechova, J. Libantova*
Institute of Plant Genetics and Biotechnology, Slovak Academy of Sciences, P.O. Box 39A, 950 07Nitra, Slovak Republic
Поступила в редакцию 10.09.2014 г.
Принята к печати 12.12.2014 г.
Промоторы, специфически активные только в ходе развития мужского гаметофита трансгенных организмов, широко используются для предотвращения нежелательного переноса трансгена из трансгенных в нетрансгенные популяции растений. Поскольку специфичность и временной период активности промотора могут не совпадать в исходном и трансгенном растении, с помощью гена GUS мы проверили активность промотора APRS, выделенного из Arabidopsis thaliana, в трансгенных растениях табака. В отличие от данных транскриптомного анализа A. thaliana, проведенного с использованием микрочипов, в котором выявили активность этого промотора на поздних стадиях развития пыльцы, в растениях табака промотор APRS был активен в развивающихся микроспорах в течение короткого промежутка времени до высвобождения микроспор из тетрад. Несмотря на эти различия в растениях табака промотор APRS остается специфичным к пыльце. Однако перед использованием промотора APRS для создания с помощью систем сайт-специфической рекомбинации мужской стерильности или получения свободной от трансгена пыльцы необходимо верифицировать его специфичность в других важных сельскохозяйственных культурах.
Ключевые слова: каллоза, р-1,3-глюканаза, созревание микроспор, специфическая экспрессия, тетрады.
THE EXPRESSION PROFILE OF Arabidopsis thaliana p-1,3-GLUCANASE PROMOTER IN TOBACCO, by M. Jopcik, I. Matusikova, J. Moravcikova, D. Durechova, J. Libantova* (Institute of Plant Genetics and Biotechnology, Slovak Academy of Sciences, P.O. Box 39A, 950 07 Nitra, Slovak Republic; *e-mail: jana. libantova@savba.sk). Well characterized promoters with specific activity only during male gametophyte development of transgenic organism are widely utilized in strategies aimed at the elimination of unwanted transgene escape from the transgenic to the non-transgenic plant population. Since the specificity and timing of the applied promoter in the original and transgenic organism don't have to be consistent, here we have tested by promoter-GUS fusion analysis the APRS promoter isolated from Arabidopsis thaliana in transgenic tobacco plants. Unlike of A. thaliana transcriptomic microarray data that identified gene expression from this promoter in late stages of pollen development, in tobacco plants the APRS promoter was active in the developing microspores during a short period of time before the microspores are released from the tetrads. Despite these discrepancies, the APRS promoter remains strictly pollen specific in tobacco plants. However, verification of its specificity in other important crops should precede the use of the APRS promoter in the engineered male sterility or in production of transgene-free pollen via site-specific recombination systems.
Keywords: callose, p-1,3-glucanase, microspores maturation, specific expression, tetrads. DOI: 10.7868/S0026898415040060
К настоящему времени разработано несколько стратегий, затрудняющих нежелательное попадание трансгена из трансгенных растений в нетрансгенные популяции. В двух наиболее распространенных стратегиях — конструировании мужской стерильности и сайт-специфических системах рекомбинации, используются специфичные для мужского гаметофита промоторы, которые позволяют
# Текст представлен на английском языке.
* Эл. почта: jana.libantova@savba.sk
предотвратить образование пыльцы или обеспечивают продукцию пыльцы, не содержащей трансген [1]. Первый подход включает, например, экспрессию гена цитотоксического белка барназы, контролируемую тапетальным промотором ТА29, которая приводит к избирательному удалению выстилающего слоя на определенном этапе (промежутке времени) развития пыльников [2]. Второй подход
включает вырезание трансгена специфической ре-комбиназой, контролируемой промотором, специфичным для пыльцы [3]. В обоих подходах часть потомства сохраняет трансгенность, поскольку промоторы остаются неактивными в ходе женского гаметогенеза и эмбриогенеза [4].
К настоящему времени охарактеризовано ограниченное число промоторов со строго контролируемой активностью на разных стадиях развития мужского гаметофита. Кроме промотора TA29 табака [5], к ним относятся промоторы генов LAT52, LAT59 томата [6, 7], ZM13 кукурузы [8], NTP303 табака [9], AtPTEN1 Arabidopsis thaliana [10], NTM19 табака [4] или AtSTP2 A. thaliana [11]. Доступность других промоторов из разных источников дает больше возможностей для использования упомянутых подходов для других видов растений [1].
Специфичные для мужского гаметофита промоторы регулируют экспрессию генов в ходе мик-роспорогенеза и/или микрогаметогенеза. Мик-роспорогенез включает события, которые ведут к образованию гаплоидных одноклеточных микроспор из материнских пыльцевых клеток, локализованных в центре развивающегося пыльника и окруженных четырьмя слоями ткани пыльника. Клетки самого внутреннего слоя — тапетума — метаболически высокоактивны, они контролируют созревание микроспор из тетрад с образованием пыльцевых зерен, на которых постепенно образуется внешняя экзина [12]. Микроспоры встроены в каллозу. Для их высвобождения из тетрад в пыльцевые камеры, где они созревают и превращаются в пыльцевые зерна, необходимы деградирующие ферменты, включая Р-1,3-глюканазы, секретируемые тапетумом [13—16].
На основе анализа экспрессии с использованием микрочипов [17] и филогенетического анализа [18] 50 глюканаз A. thaliana разделили на 13 групп. Гены Р-1,3-глюканаз, принадлежащих к группам H и K, выполняют специфичные для репродуктивных тканей функции. В группу K входят два активно экспрессирующихся гена (At4g14080 и At3g23770) и три слабо экспрессирующихся гена (At3g24330, At3g61810 и At3g55780), специфичных для пыльников. Продукты этих генов отвечают за растворение каллозы, окружающей тетрады [19, 20]. Два гена, специфичных для пыльцы/тычинки, At5g64790 и At5g20390, принадлежат к группе H и экспресси-руются в матриксе столбика, где их продукты гид-ролизуют каллозу в ходе роста пыльцевой трубки [18, 21, 22].
Поскольку тканевая специфичность и временной период активности промотора в исходном и трансгенном организме могут не совпадать, мы сфокусировали наше внимание на проверке активности 5'-регуляторной последовательности (APRS) гена At5g20390 в трансгенных растениях табака, прежде чем использовать его в биотехнологических
разработках. С этой целью выделенный промотор присоединили к репортерному гену gfp:gus в бинарном растительном векторе pCAMBIA1304. Чтобы защитить промотор APRS от нежелательной интерференции с расположенным поблизости 35S промотором вируса мозаики цветной капусты (CaMV), между двумя экспрессионными единицами, ориентированными голова к голове, встроили спейсер-ную последовательность размером 5 т.п.н. GUS-специфичное окрашивание тканей развивающихся микроспор подтвердило, что в трансгенных растениях табака промотор APRS гена At5g20390, кодирующего ß-1,3-глюканазу, специфически экспрес-сируется на ранних стадиях развития пыльцы до выхода микроспор из тетрад.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Растительный материал. Растения Nicotiana ta-bacum L. (cv. Petit Havana SR1), используемые для генетической трансформации, культивировали in vitro в среде MS ("Duchefa", Нидерланды), содержащей 2% (в/об.) сахарозы и 0.8% (в/об.) агара, при 20 ± 2°C с 16-часовым фотопериодом и интенсивностью освещения 80 мЕ м-2 с-1.
Получение векторной конструкции и трансформация растений. Промотор APRS вместе с 5'-не-транслируемой областью (UTR) гена At5g20390 выделили из геномной ДНК A. thaliana в виде фрагмента длиной 684 п.н. с использованием ПЦР и клонировали в векторе pCAMBIA1304 [23] путем замещения 35S промотора CaMV, слитого с репортерными генами gfp:gus [24]. Для минимизации влияния встроенных растительных регуля-торных или энхансерных элементов между единицами экспрессии APRS:gfp:gus и CaMV35S:hpt в конструкцию p5SCAPRS внедрили спейсерную последовательность размером 5 т.п.н. (рис. 1) [25]. Затем p5SCAPRS ввели в Agrobacterium tumefaciens (штамм LBA 4404), используя метод замораживания-оттаивания [26].
Листовые диски табака (N. tabacum L. cv. Petit Havana SR1) трансформировали по методу Horsch [27]. Сначала диски кокультивировали на чашках Петри с ночными культурами клеток Agrobacteri-um, разведенными до оптической плотности 0.6 при 600 нм в жидкой среде CIM (каллус-индуци-рующая среда), состоящей из среды MS, 30 г/л сахарозы, 1 мг/л NAA (а-нафтилуксусная кислота, "Duchefa"), 0.2 мг/л BAP (бензиламинопурина "Duchefa"), pH 5.7, в темноте в течение 2 дней.
Образование каллусов на листовых дисках табака происходило на твердой среде SIM, индуцирующей рост побегов, состоящей из среды MS, 30 г/л сахарозы, 0.1 мг/л NAA, 1 мг/л BAP, 8 г/л растительного агара, 30 мг/л гигромицина ("Duchefa") и 500 мг/л цефотаксима ("Duchefa"), pH 5.7. Побеги, выросшие из листовых дисков, укореняли
LB 35S-T hpt 35S-P
P3 P4
Г Л
5S
P1 P2
ГЦ
APRS gfp:gus nos-T
RB
а
б
M T1 T2 T3 T4 T5 T6 NT
Рис. 1. a — T-ДНК бинарного вектора p5SCAPRS. Фрагмент размером 0.68 т.п.н., несущий промотор APRS, был соединен с репортерными генами gfp:gus в рамке считывания. Чтобы предотвратить влияние 35S энхансера CaMV на исследуемый тканеспецифический промотор, которое могло привести к эктопической активности, между примоторами встроили спейсерный фрагмент размером 5 т.п.н. (5S). б — Верификация трансформантов 5SCAPRS с помощью ПЦР. ПЦР проводили на геномной ДНК растений, трансформированных 5SCAPRS, с праймерами P1/P2 и P3/P4, дающими ампликоны размером 478 и 308 п.н. соответственно. M — маркеры длины 100 bp GeneRuler ("Thermo Scientific", Германия), T1—T6 — трансгенные растения, NT — нетрансгенны
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.