ГЕНЕТИКА, 2013, том 49, № 3, с. 366-375
ГЕНЕТИКА ЧЕЛОВЕКА
УДК 575:599.9
ПРОФИЛЬ МЕТИЛИРОВАНИЯ ГРУППЫ ГЕНОВ микроРНК ПРИ СВЕТЛОКЛЕТОЧНОМ ПОЧЕЧНОКЛЕТОЧНОМ РАКЕ; СВЯЗЬ С ПРОГРЕССИЕЙ РАКА
© 2013 г. Е. В. Береснева1, С. В. Рыков1, Д. С. Ходырев1, И. В. Пронина1, В. Д. Ермилова2,
Т. П. Казубская2, Э. А. Брага1, 3, В. И. Логинов1, 3
Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва 117545 2Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина Российской академии медицинских наук, Москва 115478 3Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук, Москва 115478 e-mail: eleonora10_45@mail.ru, loginov7@genetika.ru Поступила в редакцию 30.03.2012 г. Окончательный вариант получен 10.07.2012 г.
МикроРНК регулируют экспрессию генов, участвуют во многих клеточных процессах и активно вовлечены в развитие онкологических заболеваний. Регуляция экспрессии самих генов микроРНК может осуществляться посредством метилирования CpG-островков, что показано при разных видах опухолей. Метилирование генов микроРНК при светлоклеточном почечноклеточном раке (скПКР) по данным литературы изучено, главным образом, для генов семейств miR-9 и miR-34. Нами исследовано метилирование шести генов микро-РНК (miR-124a-2, miR-124a-3, miR-9-1, miR-9-3, miR-34b/c, miR-129-2) с использованием представительной выборки образцов скПКР (46 случаев). Метилирование трех генов miR-124a-2, miR-124a-3 и miR-129-2 в опухолях почки изучено впервые. Анализ метилирования проведен с применением метилспецифичной ПЦР. Показано, что при скПКР частота метилирования исследованных шести генов в образцах опухолей варьирует от 37% до 65% и значимо выше, чем в образцах гистологически нормальной ткани (Р< 3 х 10-5 по Фишеру). Выявлены корреляции частоты метилирования ряда генов микроРНК с показателями прогрессии скПКР (размером опухоли, стадией, потерей дифференцировки, образованием метастазов).
DOI: 10.7868/S001667581303003X
МикроРНК представляют собой однонитевые короткие РНК (19—25 н), не кодирующие белок и способные участвовать в регуляции генов на пост-транскрипционном уровне [1]. К настоящему времени известно более двух тысяч микроРНК человека (miRBase, http://www.mirbase.org/), каждая из которых может регулировать работу сотен генов-мишеней (TargetScan, http://www.targetscan. org/). Широко изучены профили экспрессии генов микроРНК при разных видах рака ("signatures miRNAs"), так как они оказались высокоспецифичными для рака легкого, толстой кишки, яичников, молочной железы и их гистологических типов [2]. Одним из путей регуляции экспрессии генов микроРНК является изменение метилирования CpG-островка, прилежащего или перекрывающего ген микроРНК [3]. Для эпителиальных опухолей легкого, толстой кишки, молочной железы и других органов построены профили метилирования генов микроРНК, которые полезны для диагностики и прогноза развития заболевания [4, 5].
Почечноклеточный рак (ПКР) представляет собой наиболее распространенный тип рака почки. Ежегодно в мире регистрируется более 200 тыс. новых случаев ПКР и 100 тыс. смертей, что позволяет считать это заболевание одной из важнейших проблем онкоурологии [6]. Только в России за 2010 г. выявлено почти 19 тыс. новых случаев ПКР, что составляет 3.6% от общего числа зарегистрированных случаев злокачественных новообразований за этот год [7]. Причем наблюдается "прирост" новых случаев ПКР. Так, с 2000 г. до 2010 г. число выявленных за один год случаев увеличилось на 41% [7]. ПКР состоит из гетерогенной группы эпителиальных опухолей, среди которых свет-локлеточный почечноклеточный рак (скПКР) встречается наиболее часто и составляет 70—80% ПКР и протекает более тяжело по сравнению с папиллярным раком почки и хромофобными опухолями. Примерно треть пациентов после резекции локализованного скПКР имеют рецидив заболевания, а поскольку химиотерапия малоприменима к скПКР, средняя выживаемость пациентов с метастазами составляет немногим
больше года [7—9]. Приведенные сведения о распространенности и клинических особенностях скПКР показывают необходимость изучения молекулярных механизмов развития опухолей почки, что позволит идентифицировать новые моле-кулярно-генетические маркеры скПКР и расширить возможности диагностики, прогноза и лечения этого тяжелого заболевания.
К настоящему времени для скПКР получен ряд данных о роли микроРНК в развитии и прогрессии этого заболевания, в регуляции генов-мишеней и определены профили экспрессии группы генов микроРНК [10—12]. Так как роль гена von-Hippel-Lindeau (VHL) установлена и для семейного, и для спорадического рака почки, при изучении спектра генов микроРНК, изменяющих уровень экспрессии, в первую очередь рассматривают гены, связанные с VHL-зависимой регуляцией [13]. Исследования метилирования генов микроРНК при скПКР ограничиваются отдельными публикациями и касаются, главным образом, генов семейств miR-9 и miR-34 [9, 14].
Цель настоящей работы — изучение метилирования CpG-островков группы генов микроРНК при скПКР и возможной связи этих эпигенетических изменений с прогрессией скПКР.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Образцы первичных опухолей скПКР были собраны и клинически охарактеризованы в НИИ клинической онкологии РОНЦ РАМН. Исследовали первичные опухоли почки и только от тех больных, которые до операции не получали лучевую или химиотерапию. Все опухоли почки классифицированы в соответствии с TNM-классифи-кацией Международного противоракового союза (UICC, версия 2002 г.) [15] и гистологически верифицированы на основании критериев классификации Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) [16]. Для отбора образцов с высоким содержанием опухолевых клеток (не менее 70%) проводили дополнительный гистологический анализ микросрезов (3—5 мкм), окрашенных эозином и гематоксилином. Образцы тканей хранили при —70°С. Высокомолекулярную ДНК выделяли из ткани по стандартной методике, как описано ранее [17]. Исследованы парные образцы опухолевой и гистологически нормальной ткани от 46 пациентов, страдающих скПКР. В качестве дополнительного контроля использованы ткани почки от 10 умерших человек, не имеющих в анамнезе онкологических заболеваний.
Выбор для анализа генов микроРНК, связанных с развитием опухолей и ассоциированных с CpG-островками, проводили с привлечением следующих баз данных: UCSC Genome Browser (hg 18 (http ://genome.ucsc.edu/)), MicroRNAdb (http://bio-
info.au.tsinghua.edu.cn/micrornadb/), miRDB (http:// mirdb.org/cgi-bin/search.cgi), miRGen (http:// www.diana.pcbi.upenn.edu/miRGen.html), TargetScan (http://www.targetscan.org/), miR2Disease Base (http://www.mir2disease.org/), miRWaik (http:// www. ma.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/), CpGclus-ter (http://bioinfo2.ugr.es/CpGcluster/), miRBase (http://www.mirbase.org/).
Бисульфитную конверсию ДНК и метилспеци-фичную ПЦР проводили по методу [18]. 0.5—2 мкг ДНК денатурировали в растворе 0.3 М NaOH и инкубировали при 37°С 15 мин, после чего смесь охлаждали во льду. Затем добавляли раствор Na2S2O3 и гидрохинона (рН 5.0) до конечных концентраций 3.6 М и 0.5 мМ, соответственно. Далее применяли повторные денатурации/конверсии по программе — 15 циклов: 30 с при 95°C и 15 мин при 53—55°C, под минеральным маслом. Обработанную таким образом ДНК очищали, используя колонки Centrifugal Filter Microcon, Ultracel YM-30 ("Millipore", США). Далее ДНК инкубировали при комнатной температуре 10 мин в растворе 0.3 М NaOH, щелочь нейтрализовали 5 М ацетатом аммония (рН 7.0) и ДНК переосаждали тремя объемами 96%-ного этанола. Высушенный осадок ДНК растворяли в бидистилированной воде и использовали в качестве матрицы при проведении метилспецифичной ПЦР (МС-ПЦР). Для анализа метилирования каждой микроРНК использовали две пары праймеров, специфичных как к метилированному, так и к неметилирован-ному аллелю (табл. 1). МС-ПЦР проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ трис-HCl, рН 8.8; 16.7 мМ (NH4)2SO4; 0.01% Tween-20; 1.5 мМ MgCl2; 0.25 мМ каждого dNTP; 10—20 нг ДНК; 25 пмоль каждого праймера; 0.5 ед. Hot Start 7а#-ДНК-полимеразы ("СибЭн-зим", Россия). Праймеры из [4, 19, 20], температура отжига (Тотж) и размеры продукта ПЦР приведены в табл. 1. ПЦР проводили по программе: 95°С, 2 мин; 35 циклов {92°С, 10 c; Тотж (табл. 1), 25 с; 72°С, 25 с}; 72°С, 3 мин на амплификаторe DNA Engine Dyad Cycler ("Bio-Rad", США). Для каждой пары праймеров проверяли отсутствие продукта ПЦР на неконвертированной ДНК. Образцы ДНК из лейкоцитов крови здоровых доноров использовали как контроль для неметилиро-ванных аллелей. В качестве позитивного контроля 100%-ного метилирования использовали препараты ДНК из лейкоцитов, обработанные метил-трансферазой SssI ("СибЭнзим", Россия). Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 2%-ном агарозном геле и в 10%-ном полиакри-ламидном геле (при длине продукта ПЦР менее 100 пн).
Статистический анализ проводили с применением точного критерия Фишера. Уровень значимости принят равным 0.05. Рассматривали также результаты статистически маргинально значимые
Таблица 1. Праймеры и условия МС-ПЦР
Обозначения праймеров* Структура праймеров (5'—3') Т °C J отж> ^ Размер продукта, пн Ссылка
miR-129-2-mF gattttagttcgtattaatgagttggcggtttc 52 210 [20]
miR-129-2-mR aaccccgactacaaaatcgcg
miR-129-2-uF tgattttagtttgtattaatgagttggtggttttg 52 210 [20]
miR-129-2-uR accaaccccaactacaaaatcaca
miR-9-1-mF ttttattttcgttgacgggc 56 120 [4]
miR-9-1-mR cccgcctcctaactactatcg
miR-9-1-uF tttttttatttttgttgatgggt 56 120 [4]
miR-9-1-uR cccacctcctaactactatcacc
miR-9-3-mF ggtgttaggacgtacggaac 58 180 [4]
miR-9-3-mR2 tacccgaatcctaaaacgc
miR-9-3-uF2 ggtgttaggatgtatggaat 58 170 [4]
miR-9-3-uR tacccaaatcctaaaacac
miR-34b/c-mF tttagttacgcgtgttgtgc 58 185 [4]
miR-34b/c-mR actacaactcccgaacgatc
miR-34b/c-uF tggtttagttatgtgtgttgtgt 58 190 [4]
miR-34b/c-uR caactacaactcccaaacaatcc
miR-124a-2-mF ggtttatgtatgtttttaggcg 49 93 [19]
miR-124a-2-mR tccgtaaaaatataaacgatag
miR-124a-2-uF taggtttatgtatgtttttaggtg 49 99 [19]
miR-124a-2-uR ctattccataaaaatataaacaataca
miR-124a-
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.