научная статья по теме ПРОГРЕСС В ИССЛЕДОВАНИИ САЙТ-ОРИЕНТИРОВАННОЙ И ТРЕХМЕРНОЙ ИММОБИЛИЗАЦИИ БЕЛКОВ Биология

Текст научной статьи на тему «ПРОГРЕСС В ИССЛЕДОВАНИИ САЙТ-ОРИЕНТИРОВАННОЙ И ТРЕХМЕРНОЙ ИММОБИЛИЗАЦИИ БЕЛКОВ»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 1, с. 3-25

= ОБЗОРЫ

УДК 577.101

ПРОГРЕСС В ИССЛЕДОВАНИИ САЙТ-ОРИЕНТИРОВАННОЙ И ТРЕХМЕРНОЙ ИММОБИЛИЗАЦИИ БЕЛКОВ*

© 2015 г. C. Wang, B. Feng*

College of Chemical Engineering, Xiangtan University, Xiangtan 411105, Hunan Province, China

Поступила в редакцию 18.01.2014 г.

Принята к печати 28.04.2014 г.

В постгеномную эру целью исследований становится понимание информации, хранящейся в секвениро-ванной ДНК, а именно понимание функциональных характеристик белков, кодируемых различными геномами. Технологии белковых микрочипов, в частности миниатюрные высокопроизводительные платформы, такие как проточные микро- или наночипы, которые позволяют детектировать одновременно тысячи белков, становятся все более важными инструментами исследования протеомов. Эти технологии основаны на принципах молекулярного узнавания, в них используются различные поверхности, такие как стеклянные слайды, шарики или микролунки, к которым прикреплен набор исследуемых белков. Однако иммобилизованные белки часто утрачивают способность связывать антитела, а также имеют низкую поверхностную плотность, что приводит к низкому уровню сигнала и неэффективной детекции. В настоящем обзоре основное внимание уделено успехам в области сайт-ориентированной адсорбции белков на границах раздела твердой и жидкой фаз, особенно трехмерной иммобилизации белков, цель которой состоит в сохранении активности иммобилизованных белков в условиях их высокой поверхностной плотности.

Ключевые слова: белок, сайт-ориентированная иммобилизация, трехмерная иммобилизация, твердофазное антитело, антиген-мишень.

RESEARCH PROGRESS ON SITE-ORIENTED AND THREE-DIMENSIONAL IMMOBILIZATION OF PROTEINS, by C. Wang, B. Feng* (College of Chemical Engineering, Xiangtan University, Xiangtan 411105, Hunan Province, China; *e-mail: fengbo@xtu.edu.cn, fengbo5460@hotmail.com). In today's postgenome era, the goals of research are geared toward understanding the meaning of information in sequenced DNA, namely, understanding the functional characteristics of proteins encoded by genomes of living beings. Protein array technologies, particularly miniaturized high-throughput platforms such as micro- or nano-fluidic chips that allow the parallel detection of thousands of proteins simultaneously, are playing increasing important roles as discovery tools in proteomics. These technologies are based on principles of molecular recognition and consist of a support surface, such as a glass slide, bead, or microtiter plate, to which an array of captured proteins is bound. However, immobilized proteins often lose their immunoactivity and suffer from low surface density, which results in inefficient signal response. In this review, we mainly provide an introduction about the research progress on site-oriented adsorption of protein at solid-liquid interfaces, especially the three-dimensional immobilization of protein, whose objective is to retain immobilized proteins in an active state at great density.

Keywords: protein, site-oriented immobilization, three-dimensional immobilization, solid-phase antibody, target antigen.

DOI: 10.7868/80026898415010176

ВВЕДЕНИЕ

Белки — это макромолекулы, обладающие огромным разнообразием [1], которые играют ключевую роль в проведении сигналов внутрь клеток, в иммунном ответе, прохождении клеточного цикла и других биологических процес-

#Текст представлен авторами на английском языке.

* Эл. почта: fengbo@xtu.edu.cn, fengbo5460@hotmail.com

сах. С недавнего времени большое внимание уделяется изучению физических и химических свойств белков. Развитие белковых технологий привело к тому, что методы иммобилизации белков включают не только случайную адсорбцию, но и 3Э-ад-сорбцию, что позволяет быстро и легко выявлять

Рис. 1. Схема белкового микрочипа: пример использования иммуносорбента и конъюгированного с ферментом антитела.

ТУТ

Шаг 1: Покрыть микропланшет специфичным антителом. Заблокировать и промыть. Шаг 2: Добавить образец и проинкубировать. Образец-мишень связывает иммобилизованное антитело. Шаг 3: После отмывки добавить биотинилированное антитело и проинкубировать, при этом образуется похожий на сэндвич комплекс из двух разных антител и мишени.

V V V «> ? л

Шаг 4: После отмывки добавить авидин-HRP (пероксидаза хрена), который связывает биотинилированное антитело. Шаг 5: После промывки добавить хромогенный субстрат пероксидазы ТМВ, который под действием фермента превращается в окрашенный синий продукт. Шаг 6: После терминации реакции, вызванной добавлением серной кислоты, синий продукт превращается в желтый. Определить поглощение при 450 нм.

Чр Образец Биотин -^f- Авидин HRP

одновременно тысячи интересующих нас элементов путем параллельных измерений. В настоящее время такой подход считается очень привлекательным, поскольку он позволяет проводить прямые измерения и может использоваться в клинических приложениях даже в случае минимального иммунного ответа.

На рис. 1 приведена схема классического метода измерения с помощью антител — иммуносорбции, совмещенной с использованием конъюгированных ферментов (ELISA). Сначала антигены-мишени образца захватываются "твердофазными" антителами, иммобилизованными на поверхности микропланшета. Другое антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (или щелочной фосфатазой), связывается с другим участком на поверхности белкового антигена, образуя иммунный комплекс-сэндвич из двух разных антител состава "иммобилизованное твердофазное антитело-антиген-мишень, конъюгированное с ферментом антитело". Содержание антигена-мишени в об-

разце затем измеряют по количеству хромогенно-го субстрата, вступившего в катализируемую ферментом реакцию. Конъюгированное с ферментом антитело можно заменить биотинилированным антителом. При этом, чтобы усилить детектируемый сигнал добавляют конъюгат авидина с ферментом. Технология белковых микрочипов возникла на основе конъюгатов антител с ферментами. Снижение размера лунок при одновременном увеличении их количества на микропланшете, направленное на дальнейшую миниатюризацию, фактически превращает планшет в чип с микропорами, а уменьшение глубины лунок постепенно приводит к появлению плоских микрочипов. Одновременно с этим автоматизация обеспечивается применением проточных систем (например, в случае анализа впрыскиванием в поток) и различных принципов детекции (например, технологий, основанных на оптических, акустических и микрогравитационных методах, в которых метка не используется [2—5]).

Рис. 2. Схематическое представление моделей иммобилизации на поверхности субстрата. a — Спонтанная иммобилизация, при которой активные сайты антител могут быть частично или полностью заблокированы поверхностью субстрата. б — Ориентированная иммобилизация, когда все активные сайты полностью экспонированы, что обычно приводит к снижению поверхностной плотности иммобилизованных антител, поскольку Fc-связывающие домены промежуточных белков не всегда доступны для антител. в — У трехмерного субстрата способность связывать антитела гораздо выше, чем у обычного двумерного. Главная проблема заключается в плохом обмене буферными растворами из-за ограничений в переносе молекул. г — Трехмерная иммобилизация антител на плоском субстрате за счет образования упорядоченных ориентированных агрегатов иммуноглобулинов (IgG) и белка А стафилококка (SPA).

Самая большая проблема технологии микрочипов на основе антител — это твердофазное состояние антител, т.е. проблема эффективного размещения и прикрепления к субстратам, распределения на поверхности твердой фазы максимального числа молекул антител с целью соблюдения пространственных требований, которые определяют связь между конформацией молекул и их биологической активностью [6]. Существуют три вида иммобилизации антител на поверхности: физическая адсорбция, химическая пришивка и сайт-направленная иммобилизация. При физической адсорбции связывание зависит от неспецифических взаимодействий между антителом и поверхностью-субстратом. Этот процесс трудно контролировать. Прикрепление антител к твердой фазе с помощью химических сшивок основано на образовании ковалентных связей между активными группами в молекулах антител и на использовании модифицированной поверхности. Химическая сшивка относительно стабильна, однако вследствие структурных изменений часть молекул антител, иммобилизованных на поверхности, распадается и утрачивает биологические функции [6—8]. И в случае адсорбции, и в случае химической сшивки молекулы антител хаотично

располагаются на поверхности субстрата (рис. 2а). Только прикрепленные к поверхности антитела, антигенсвязывающие фрагменты (Fab) которых удалены от поверхности (матрикса), полностью экспонированы и доступны, могут реагировать с антигеном-мишенью. Большинство молекул антител, иммобилизованных таким образом, не способны распознавать молекулы-мишени, поскольку участки Fab, необходимые для связывания, расположены рядом с жесткой поверхностью субстрата, что затрудняет связывание и препятствует эффективному ответу, необходимому для установления корреляций между силой сигнала и концентрацией в повторяющихся тестах [8, 9].

Сайт-направленная иммобилизация антител на твердой поверхности субстрата основана на использовании промежуточных молекул (рис. 2б). Особенно это касается участков Fab, степень экспонирования которых контролируется, что обеспечивает поддержание связывающей активности и хорошей пространственной конформации по отношению к молекулам-мишеням [10]. Эта область исследований привлекла внимание ученых в Китае и других странах. Полученные результаты указывают на сохранность биологических свойств антител, адсорбированных на поверхности с помо-

щью сайт-направленной иммобилизации, и на значительно лучшую способность связывать антиген, чем при физической адсорбции или химической сшивке [5, 7, 9, 11]. Однако этот метод также не лишен недостатков (рис. 2б). Не все промежуточные молекулы могут связать молекулы антител, так что плотность иммобилизованных антител будет понижена (уменьшается количество антител, адсорби

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком