УДК 577.24
ПРОИЗВОДНОЕ ПЛАСТОХИНОНА, АДРЕСОВАННОЕ В МИТОХОНДРИИ, КАК СРЕДСТВО, ПРЕРЫВАЮЩЕЕ ПРОГРАММУ СТАРЕНИЯ
2. ТЕРАПИЯ НЕКОТОРЫХ СТАРЧЕСКИХ ПАТОЛОГИЙ, ОПОСРЕДОВАННЫХ АКТИВНЫМИ ФОРМАМИ КИСЛОРОДА (СЕРДЕЧНОЙ АРИТМИИ, ИНФАРКТА МИОКАРДА, ИШЕМИИ ПОЧКИ И ИНСУЛЬТА ГОЛОВНОГО МОЗГА)*
© 2008 г. Л.Е. Бакеева1, И.В. Барсков2, М.В. Егоров3, Н.К. Исаев1, 2, В.И. Капелько4, А.В. Казаченко5, В.И. Кирпатовский5, С.В. Козловский3,
В.Л. Лакомкин4, С.В. Левина2, О.И. Писаренко4, Е.Ю. Плотников1, В.Б. Сапрунова1, Л.И. Серебрякова4, М.В. Скулачев3, Е.В. Стельмашук2, И.М. Студнева4, О.В. Цкитишвили4, А.К. Васильева1, И.В. Викторов6, Д.Б. Зоров1, В.П. Скулачев1, 3, 7**
1 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва; факс: (495)939-0338, электронная почта skulach@belozersky.msu.ru
2 Научный центр неврологии РАН, отдел исследования мозга, 1050643 Москва, пер. Обуха, 5
3 Центр митоинженерии МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва
4 Институт экспериментальной кардиологии, Российский кардиологический научно-производственный комплекс, 121552 Москва, ул. 3-я Черепковская, 15А
5 Институт урологии Росмедтехнологий, 105425 Москва, ул. 3-я Парковая, 51
6 ФГУГосударственный научный центр социальной и судебной психиатрии им. В.П. Сербского, 119992 Москва, ГСП-2, Кропоткинский пер., 23
7 Факультет биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова , 119991 Москва
Поступила в редакцию 29.12.07
Исследовано действие 10-(6'-пластохинонил) децилтрифосфония (SkQ1) и 10-(6'-пластолхинонил) децил-родамина 19 (SkQRl) ex vivo и in vivo на крысиных моделях сердечной аритмии и инфаркта миокарда, вызванных H2O2 и ишемией/реперфузией, а так же ишемии почки и ишемического инсульта. Во всех перечисленных моделях SkQ1 или SkQRl оказывали заметное защитное действие. Найдено, что добавка в пищу крайне малых количеств SkQl (до 0,02 нмоль SkQl/кг в день в течение трех недель) уменьшает сердечную аритмию, вызванную перфузией изолированного сердца крысы раствором с H2O2 или ишемией/ реперфу-зией. Показано, что более высокие концентрации SkQl (125—250 нмоль/кг в день в течение 2—3 недель) уменьшают размер инфарктной зоны, вызванной ишемией/реперфузией сердца in vivo, и снижают содержание в крови лактатдегидрогеназы и сердечной изоформы креатинкиназы, уровень которых возрастает в результате ишемии/реперфузии. Установлено, что у крыс с единственной почкой 90 мин ишемия/реперфузия этой почки приводит к гибели большинства животных через четыре дня, в то время как однократная инъекция SkQ1 или SkQR1 (1 мкмоль/кг за день до ишемии) спасает жизнь почти всех крыс. Введение SkQR1 сопровождается уменьшением АФК в клетках почек, нормализацией креатинина крови и некоторых других контролируемых почкой параметров. В то же время, показано, что SkQ1, обладающий меньшей, чем SkQR1 способностью проникать через мембраны, спасает жизнь, но не приводит к нормализации содержания АФК в клетках почки и креатинина в крови. Предполагается, что гибель животного, обусловленная почечной дисфункцией, опосредуется некой системой вне почки, которая является мишенью для SkQ1. При ис-
Принятые сокращения: АФК- активные формы кислорода; ИСФ - интенсивность сократительной функции сердца; КК - креатинкиназа, ЛДГ - лактатдегидрогеназа, TTX - хлорид 2,3,5-трифенилтетразолия, DCF - 5-(-6)-дегидро-2',7'-дихлорфлуоресцеиндиацетат, MTT - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий, SkQl - 10-(6'-пластохинонил) децилтрифосфоний, SkQRl - 10-(6'-пластолхинонил) децилродамин 19, SkQ - катионное производное пластохинона или метилпластохинона; TMRE - этиловый эфир тетраметилродамина; ЗР — зона риска, ЛЖ — левый желудочек сердца.
* Английский вариант рукописи будет опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press BM 08-265.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
1607
пользовании модели компрессионной ишемии/реперфузии мозга показано, что однократное введение крысам за день до операции 1 мкмоль 8крЯ1/кг уменьшает размер очага повреждения мозга. На этой модели был неэффективен предположительно вследствие более низкой проницаемости гематоэнцефали-ческого барьера для данного вещества.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: митохондрии, антиоксидант, аритмия, сердце, почка, инфаркт, инсульт.
В первой статье из этой серии [1] мы описали синтез, физико-химические свойства, анти-и прооксидантную активности катионных производных пластохинона (8кр). Было показано, что крайне малые (нМ) концентрации 8кр1 и 8крМ действуют как высокоэффективные ан-тиоксиданты в водных растворах, липидных мицеллах, липосомах, изолированных митохондриях и клеточных культурах. В данной части мы попытались использовать те же проникающие катионы как средства терапии для лечения наиболее общих возрастных заболеваний, которые опосредуются АФК. Среди них исследовались сердечная аритмия, инфаркт миокарда, ишемия почки, а также инсульт головного мозга. Полученные данные находятся в согласии с предположением, что возрастные болезни ишемичес-кого сердца, мозга и почки, равно как и аритмия, вызванная перекисью водорода, опосредуются внутримитохондриальными АФК и патологическое увеличение количества этих АФК может быть устранено посредством 8кр.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Изучение аритмии ex vivo. Самцы крыс линии Вистар весом 300—350 г получали стандартную лабораторную диету с добавлением 20 г творога с бромидом SkQ1 от 0,02 до 250 нмоль/кг в день в течение трех недель. Крысы контрольной группы вместо SkQ1 получали бромид натрия в тех же дозах.
Все исследования, описанные в этой статье, проводились в соответствии с институтским руководством по работе с животными. Крысы были анестезированы уретаном (1,7 г/кг веса); изолированные сердца перфузировались через аорту при 37° модифицированным раствором Кребса— Хензелейта, содержавшим 11 мМ глюкозы и насыщенным карбогеном (95% O2 и 5% CO2). Перфузия была выполнена при помощи перистальтического насоса с контролируемой скоростью приблизительно при 10 мл/мин на г. Давление в латексном баллоне, введенном в полость левого желудочка, постоянно контролировалось посредством электроманометра Gould Statham P23Db и рекордера Gould 2400S («Gould Statham Inc.», США). Произведение развиваемого давления на частоту сокращений служило мерой интенсивности сократительной функции (ИСФ).
Протокол экспериментов с применением перекиси водорода включал оценку инотропно-го сердечного ответа на двукратное увеличение скорости перфузии. В коронарные сосуды в течение 40 мин вводилась 0,1 мМ H2O2. Протокол опытов по ишемии/реперфузии включал 20-мин перфузию (10 мл/мин на грамм) с последующей 30-мин тотальной нормотермической ишемией и 50-мин реперфузией. Функциональные параметры регистрировали каждые 5 мин при пре-перфузии и каждую минуту при ищемии/репер-фузии. Для оценки аритмии была применена следующая четырехбальная шкала: частота сердечных сокращений в интервалах: 90—180/мин — 1 балл, 1—90/мин или 450/мин и выше — 2 балла, фибрилляция — 4 балла.
Данные статистически обрабатывали по критерию Стьюдента. Результаты представлены как среднее значение ± ошибка среднего.
Исследование инфаркта миокарда in vivo. Были использованы самцы крыс линии Вистар 300—450 г. Животных содержали при температуре около 23,5° и световом цикле 12 : 12 ч. Коммерческая твердая диета давалась ad libitum. Две серии опытов были выполнены с разной продолжительностью применения SkQ1. В первой серии SkQ1 добавляли в течение двух недель в трех дозах: 25, 125 и 500 нмоль/кг в день. Во второй серии животные получали SkQ1 в течение трех недель в дозах 2,5 и 250 нмоль/кг в день. Бромид SkQ1 растворяли в 0,1 M KH2PO4, pH 6,0. Контрольную группу содержали на стандартной диете с добавкой NaBr, растворенным в 0,1 М KH2PO4, рН 6,0 в дозе 250 нмоль/кг в день в течение двух или трех недель. Каждая группа состояла из 9—12 животных.
У наркотизированных 20%-ным уретаном крыс линии Вистар (120 мг/кг веса, внутрибрю-шинно) в условиях трахеотомии осуществляли искусственную вентиляцию легких комнатным воздухом с помощью аппарата KTR-5 («Hugo Sacks Electronik», Германия). Яремную вену катетеризировали для окрашивания сердца раствором Эванса в конце опыта. Сонную артерию катетеризировали для регистрации артериального давления с помощью мингографа-804 («Siemens Elema», Германия). Для создания региональной ишемии миокарда левый желудочек прошивали атравматической иглой 5—0 под левым ушком в направлении, перпендикулярном
большой оси сердца. Затягивание лигатуры на передней нисходящей коронарной артерии (ПНА), находящейся в толще прошитого миокарда, прекращало кровоснабжение участка миокарда; ослабление лигатуры приводило к восстановлению коронарного притока. Показатели кислотно-щелочного баланса артериальной крови (рН, рО2 и рСО2) контролировали в течение всего опыта на кислотно-щелочном газоанализаторе ABL-30 («Radiometer», Дания) и поддерживали на физиологическом уровне.
После окончания препарирования следовал 30-мин период стабилизации гемодинамических показателей (исходное состояние). Региональную ишемию моделировали окклюзией ПНА на 40 мин, продолжительность последующей ре-перфузии составляла 60 мин. В конце опыта для идентификации зоны риска (ЗР) и интактной области миокарда реокклюдировали ПНА, и в яремную вену вводили 1%-ный раствор Эванса (2 мл). Затем вырезали сердце и отделяли левый желудочек, который замораживали при — 20° до определения размеров инфаркта миокарда.
Для оценки размеров инфаркта использовали метод гистохимической локализации зоны риска и зоны инфаркта при прокрашивании ткани 2,3,5-трифенилтетразолий-хлоридом (ТТХ). Готовили поперечные срезы левого желудочка толщиной около 1,5—2 мм, которые затем инкубировали 10 мин в 1% растворе ТТХ в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4 при 37°). В результате ин-тактная область была окрашена в синий цвет, неповрежденная область зоны риска — в кирпич-но-красный, а зона инфаркта оставалась неокрашенной. Полученные образцы сканировали, площади зон определяли методом компьютерной планиметрии, используя программу Imagecal. После этого срезы взвешивали для определения м
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.