УДК 577.24
ПРОИЗВОДНОЕ ПЛАСТОХИНОНА, АДРЕСОВАННОЕ В МИТОХОНДРИИ, КАК СРЕДСТВО, ПРЕРЫВАЮЩЕЕ ПРОГРАММУ СТАРЕНИЯ
4. СВЯЗАННЫЕ С ВОЗРАСТОМ ЗАБОЛЕВАНИЯ ГЛАЗ. БкО ВОЗВРАЩАЕТ ЗРЕНИЕ СЛЕПЫМ ЖИВОТНЫМ*
© 2008 г. В.В. Нероев1, М.М. Архипова1, Л.Е. Бакеева2, А.Ж. Фурсова3, Э.Н. Григорян4, А.Ю. Гришанова3, Е.Н. Иомдина1, Ж.Н. Иващенко1, Л.А. Катаргина1, И.П. Хорошилова-Маслова1, О.В. Килина2, Н.Г. Колосова3, Е.П. Копенкин5, С.С. Коршунов1,
Н.А. Ковалева4, Ю.П. Новикова4, П.П. Филиппов2, Д.И. Пилипенко2,
О.В. Робустова1, В.Б. Сапрунова2, И.И. Сенин2, М.В. Скулачев6, Л.Ф. Сотникова5, Н.А. Стефанова3, Н.К. Тихомирова2, И.В. Цапенко1, А.И. Щипанова1, Р.А. Зиновкин2, В.П. Скулачев2,6,7**
1 Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца, 105062 Москва, ул. Садово-Черногрязская, 14/19
2 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва; факс: (495)939-0338, электронная почта skulach@belozersky.msu.ru 3 Институт цитологии и генетики СО РАН, 630090 Новосибирск, пр. Лаврентьева, 10
4 Институт биологии развития им. Н.Н. Кольцова РАН, 119991 Москва, ул. Вавилова, 26
5 Московская государственная ветеринарная академия
им. К.И. Скрябина, 1094721 Москва, ул. Скрябина, 23
6 Центр митоинженерии МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва 7 Факультет биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В.Ломоносова , 119991 Москва
Поступила в редакцию 29.12.2007
Исследована возможность применения катионного производного пластохинона 8кр1 для лечения различных заболеваний глаз, связанных с повышенной продукцией активных форм кислорода (АФК). В частности, были исследованы крысы линии ОХУ8, в которых повышенное содержание АФК приводит к развитию преждевременного старения (прогерии). Показано, что добавление к пище малых доз 8кр1 (50 нмоль/кг в день) предотвращает развитие катаракты и ретинопатий, перекисное окисление липидов и карбонилирова-ние белков в скелетных мышцах и снижение минерализации костей (остеопороз). Введение капель 250 нМ 8кр1 оказывало терапевтическое действие на уже развившиеся катаракту и ретинопатии у крыс линии ОХУ8 в возрасте 3—12 месяцев. Были исследованы экспериментальные увеит и глаукома, вызванные у кроликов соответственно иммунизацией аррестином и инъекциями оксипропилметилцеллюлозы в переднюю камеру глаза. Показано, что введение глазных капель, содержащих 250 нМ 8кр1 (4 капли в день), предотвращает развитие увеита. Капли с 5 мкМ 8кр1 (одна капля в день) препятствовали развитию глаукомы. Предпринята попытка применения препарата 8кр1 в ветеринарной практике. Лечение каплями 250 нМ 8кр1 получали 271 животное (собаки, кошки и лошади), страдавшие ретинопатиями, увеитом, конъюнктивитом и заболеваниями роговицы. В 242 случаях наблюдался выраженный терапевтический эффект. Среди
Принятые сокращения: МДА — малоновый диальдегид, АФК — активные формы кислорода, ПЭС — пигментный эпителий сетчатки, SkQ — катионные производные пластохинона или метилпластохинона, SkQ1 — 10-(6'-пластохиноил)-децилтрифенилфосфоний.
* Английский вариант рукописи будет опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press BM 08-267.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
1641
животных, страдавших ретинопатиями, к моменту начала лечения 89 уже ослепло. В 67 случаях после лечения SkQ1 зрение восстановилось. В экспериментах ex vivo было установлено, что 20 нМ SkQ1 ингибировал макрофагальную трансформацию клеток пигментного эпителия при культивации заднего сектора глаза. Этот эффект возможно связан с наблюдаемым терапевтическим действием SkQ1 in vivo. Полученные результаты позволяют заключить, что применение SkQ1 перспективно при лечении ретинопатий, катаракты, увеита, глаукомы и некоторых других заболеваний глаза.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: митохондрии, антиоксиданты, ретинопатии, катаракта, увеит, глаукома.
В предыдущих работах мы показали, что чрезвычайно малые количества митохондриаль-но-адресованных производных пластохинона (SkQ) обладают выраженным антиоксидантным действием в модельных липидных мембранах, в изолированных митохондриях и в культурах клеток. В последнем случае наблюдалось мощное защитное действие SkQ при апоптозе или некрозе, вызванных АФК [1]. Было установлено, что SkQ проявляет терапевтический эффект при ряде старческих заболеваний животных (аритмии, инфарктах сердца и почки, инсульте [2], а также в случае лимфом, вызванных мутациями в гене белка р53, и т.д. [3]).
В данной работе мы применили тот же подход к лечению заболеваний глаз, связанных с возрастом и с повышением уровня АФК. Дело в том, что сетчатка глаза является одной из тканей, подверженных наибольшему риску повреждения посредством АФК. Во-первых, она содержит значительное количество полиненасыщенных жирных кислот, которые являются основной мишенью для окисления под действием АФК; во-вторых, она подвергается действию света, который вызывает образование синглет-ного кислорода; в-третьих, содержание кислорода в сетчатке близко к артериальному, т.е. значительно превышает этот показатель в большинстве других тканей, при этом сетчатка относится к наиболее интенсивно дышащим тканям [4].
Существуют многочисленные указания на ведущую роль АФК в развитие основных заболеваний глаз, связанных с возрастом. Это относится к различным ретинопатиям (таким как макулодистрофия [5, 6], пигментный ретинит (retinitis pigmentosa) [7, 8], наследственная зрительная нейропатия [9]), а также глаукома [10, 11], катаракта [12, 13] и аутоиммунный увеит [14, 15]. Основной мишенью повреждающего действия АФК служат остатки полиненасыщенных жирных кислот, (прежде всего в митохонд-риальном кардиолипине). Обезвреживая мито-хондриальные АФК, SkQ эффективно защищает митохондрии от повреждения [1]. Эти наблюдения привлекли наше внимание к заболеваниям глаз как к возможной области терапевтического применения SkQ. Ниже представлены некоторые
результаты лечения с помощью SkQ животных, страдавших от ретинопатий, катаракты, увеита и глаукомы.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования крыс линии OXYS. Перекисное окисление липидов и карбонилирование белков в скелетных мышцах крыс линий OXYS и Вистар измеряли как описано в [16] и [17].
Минерализацию позвоночника и костей конечностей определяли посредством рентгеновского денситометра костей LUNAR Expert-XL.
Измерения активности изоформ цитохрома Р450. Микросомы выделяли из печени крыс OXYS, перфузированной раствором 1,15% KCl и 20 мМ Tris-HCl, pH 7,4. Перфузированную печень гомогенизировали в том же растворе, центрифугировали при низкой скорости и полученный супернатант центрифугировали при 100 000 g в течение 1 ч. Осадок микросом суспендировали в 0,1 М калий-фосфатном буфере, pH 7,4, содержавшем 20% глицерина.
Содержание изоформ цитохрома P450 CYP1A1, CYP1A2, CYP2B + CYP2C и CYP2B1 определяли флуориметрически по скорости образования ре-зоруфина из соответственно 7-этоксиризоруфи-на, 7-метоксиризоруфина, 7-бензоксиризору-фина и 7-пентоксиризоруфина [18].
Офтальмологические исследования крыс линий OXYS и Вистар проводили с помощью офтальмоскопа (Betta), фундус-камеры (Opton) и щелевой лампы (Shin-Nippon SL-45). Выраженность катаракты определяли следующим образом:
1 балл — отдельные участки хрусталика с немного сниженной прозрачностью;
2 балла — отдельные участки хрусталика с сильно сниженной прозрачностью;
3 балла — сильно снижена прозрачность во всем кортексе или ядре хрусталика.
В случае ретинопатии выделяли три основные стадии повреждения сетчатки:
1 балл — появление друз и других патологических изменений в пигментном эпителии сетчатки (ПЭС) и частичная атрофия хороидного слоя капилляров;
2 балла — экссудативное отслоение ПЭС и нейроэпителия сетчатки, дальнейшая атрофия хороидного слоя капилляров;
3 балла — неоваскуляризация и экссудативное геморрагическое отслоение ПЭС и нейроэпителия сетчатки, образование рубцов.
Изучение экспериментального увеита. Получение и очистка аррестина. Внешние сегменты получали из сетчатки глаза быка согласно Уил-дену и Куну [19]. Аррестин очищали, используя специфическое связывание этого белка с фос-форилированной фотоактивированной формой родопсина [20] и последующую хроматографию на колонках с DEAE-целлюлозой и c Mono Q [21].
Иммунизация кроликов аррестином. 1 мл раствора аррестина (0,8 мг/мл в физиологическом растворе) эмульгировали с равным объемом полного адъюванта Фрейнда («Sigma», США) и вводили шестимесячным новозеландским белым кроликам. Повторное введение проводили на 30-й день. Животные, получавшие только адъювант Фрейнда, служили контрольной группой. SkQ1 растворяли в 10 мМ калий-фосфатном буфере (pH 6,5), содержавшем 0,9% NaCl. После иммунизации у кроликов брали образцы крови и измеряли содержание антител методом ELISA.
Измерение содержания нитратов во влаге передней глазной камеры. Уровень окиси азота измеряли по поглощению продуктов реакции Грисса. Кратко, 100 мкл образца влаги из передней камеры глаза смешивали с 1% сульфаниламидом и 0,1% нафтилэтилендиамином. Через 10 мин инкубации при комнатной температуре концентрацию нитрата определяли по поглощению при 550 нм. Вычисляли концентрацию, сравнивая данные со стандартными растворами нитрата натрия.
Изучение экспериментальной глаукомы. Экспериментальную глаукому вызывали десятью инъекциями (2 инъекции в неделю) 0,1 мл це-лофтала (оксипропилметилцеллюлозы) в передние камеры обоих глаз кролика [22]. В правый глаз ежедневно закапывали «Вегомитин» (фармацевтическая форма SkQ1), а левый глаз использовался в качестве контроля.
Четыре кролика получали капли с 5 мкМ SkQ1, а другие четыре — с 25 мкМ SkQ1. Перед первой инъекцией измеряли параметры глаз здоровых животных. Для исследования использовали глазной тонограф GlauTest-60, ультразвуковой офтальмоскоп («Ангиодин-Офтальмо», Россия) и фундус-камеру («Cannon», Япония).
Культивация заднего сектора глаза крысы. Препараты заднего сектора глаза получали из наркотизированных взрослых (2—3 месяца) крыс
линии Вистар (процедуры соответствовали протоколам, утвержденным комиссией по биоэтике РАН). Получение препаратов, культивация в роллерах, фиксация и методы исследования
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.