ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2012, том 48, № 2, с. 218-225
УДК 579.6
ПРОЛОНГИРОВАННОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ АНАЭРОБНОГО СООБЩЕСТВА БАКТЕРИЙ, ПРОДУЦИРУЮЩЕГО ВОДОРОД
© 2012 г. Б. Ф. Белокопытов, Я. В. Рыжманова, К. С. Лауринавичюс, В. А. Щербакова
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, Московская обл., 142290
e-mail: shcherb@ibpm.pushchino.ru Поступила в редакцию 15.06.2011 г.
Исследованы различные способы длительного поддержания процесса выделения водорода при выращивании анаэробного сообщества бактерий на крахмалсодержащей среде. При культивировании в режиме отъемно-доливной ферментации в течение 72 сут образовывалось от 0.10 до 0.23 л Н2/л среды/сут. Режим регулярных пересевов продолжался более 100 сут с образованием в среднем 0.81 л Н2/л среды/сут. Выявлены достоинства и недостатки различных способов микробиологического получения водорода в темновом процессе сбраживания крахмала. Из сформированного ^-образующего сообщества микроорганизмов выделена анаэробная спорообразующая бактерия, штамм BF. Филогенетический анализ последовательности гена 16S рРНК нового штамма показал, что по своим генотипическим свойствам он относится к виду Clostridium butyricum.
Развитие современной энергетики предполагает активное внедрение различных, альтернативных ископаемым, экологически чистых источников энергии, одним из которых является водород. Получать водород можно химическими, физико-химическими, фотохимическими и микробиологическими методами. Микробиологический водород (биоводород) продуцируют анаэробные и факультативно-анаэробные бактерии при брожении (темновой процесс) в мезофильных и термофильных условиях, а также он образуется фото-синтезирующими бактериями (светозависимый процесс) [1, 2]. Основная часть проектов [3—5] по получению биоводорода, реализуемых в настоящее время, как в России, так и за рубежом, направлена на разработку систем, состоящих из биореактора для темнового образования водорода сообществами анаэробных бактерий и биореактора для светозависимого образования водорода фотосинтетиками. Важными условиями обеспечения рентабельности производственного процесса получения биоводорода, с одной стороны, является доступность и дешевизна сырья и его переработки, с другой стороны — возможность поддержания процесса достаточно длительное время на высоком уровне производительности. Как показали исследования последних лет, крахмалсодержащее сырье и отходы являются коммерчески привлекательным исходным субстратом для бактериального получения водорода [6—8], но с технологической точки зрения его использование анаэробными бактериями еще не достаточно изучено.
Цель работы — выбор способа проведения анаэробной ферментации крахмала для получе-
ния водорода сообществом анаэробных бактерий и таксономическое определение бактерий, играющих ключевую роль в исследуемом сообществе микроорганизмов.
МЕТОДИКА
Объект исследования. Исследовали анаэробное сообщество микроорганизмов ризосферы травяных растений, сформированное при культивировании на крахмалсодержащей среде в мезо-фильных условиях и представляющее смешанную культуру спорообразующих бактерий. Перед использованием в экспериментах микробное сообщество прошло длительную (более 10 пересевов) адаптацию к условиям культивирования.
Среды и условия культивирования. Ферментации анаэробного сообщества и выделение чистой культуры анаэробных бактерий проводили на среде КМ следующего состава (г/л): крахмал — 20, К2НРО4 - 5.0, КН2РО4 - 5.0, NaCl - 0.9, MgCl2 • • 6Н2О - 0.2, CaCl2 • 2H2O - 0.1, FeCl2 • 4H2O -0.15, ZnCl2 - 0.01, L-серин - 1.0, L-цистеин • HCl -0.5, раствор микроэлементов - 10 мл, раствор витаминов - 10 мл. Раствор микроэлементов содержал (мг/л): FeSO4 • 7H2O - 5.0, MnCl2 • 4H2O - 1.0, CoCl2 • 6H2O - 1.7, CaCl2 • 2H2O - 1.0, ZnCl2 - 0.1, CuCl2 - 0.1, H2BO3 - 0.1, Na2MoO4 - 0.1, NaCl -10.0, Na2SeO3 - 0.17, NiCl2 - 5.0, Na2WO4 - 1.0, нит-рилотриуксусная кислота - 128.0. Раствор витаминов содержал (мг/л): биотин - 0.02, тиамин • HCl (В1) - 0.05, п-аминобензойная кислота - 0.05, пиридоксин • HCl - 0.1, рибофлавин - 0.05, никотиновая кислота - 0.05, пантотеновая кисло-
та — 0.05, липоевая кислота — 0.05, фолиевая кислота — 0.02, цианокобаламин — 0.001.
Культивирование. Выращивание смешанной культуры бактерий осуществляли в медицинских флаконах на 500 мл и объемом среды 200 мл. Флаконы герметично закрывали специальными резиновыми пробками и алюминиевыми колпачками. Кислород из газовой фазы удалялся вакуумирова-нием в течение 3 мин. Стерилизацию сред проводили автоклавированием в режиме 0.5 атм в течение 30 мин. Ферментацию осуществляли без перемешивания при 37°С. Посевной материал пастеризовали прогреванием культуры при 80°С в течение 10 мин и добавляли к среде в количестве 1-10%.
Для выделения чистой культуры водородобра-зующей бактерии использовали анаэробную технику Хангейта [9]. Получение чистой культуры вели повторными рассевами на среду КМ с добавлением 20 г/л агара ("Difco", США) на чашках Петри, помещенных в анаэростат ("Oxoid", Великобритания), с прогреванием и повторным выделением колоний.
Параметры роста. Рост определяли по оптической плотности культуральной жидкости на спектрофотометре "Spekol 201" ("ANALYTIK JENA AG", ГДР), длина оптического пути составляла 1 см, длина волны 600 нм. рН среды и культураль-ной жидкости определяли на ионометре Анион 4101 ("Инфраспак-Аналит", Россия), заданный диапазон рН 6.2-6.5 поддерживали добавлением 50%-ного раствора КОН.
Микроскопия. Морфологию культур изучали на препаратах типа раздавленная капля с глицериновой иммерсией в режиме фазового контраста при увеличении в 1000 раз. Препараты просматривались регулярно на оптическом микроскопе ("Carl Zeiss — Axiostar plus", Германия).
Аналитические методы. Объем образующегося газа определяли по количеству вытесненной им воды [10]. Концентрацию водорода в выходящем газе измеряли на газовом хроматографе ЛХМ80 ("МПО Манометр", Россия) с использованием ка-тарометра и стеклянной колонки (1 м х 3 мм), заполненной молекулярными ситами, 30-40 меш. Температура колонки, инжектора и детектора составляла 40°С. В качестве газа-носителя использовали аргон, скорость потока 20 мл/мин. Пробу газа объемом 5 мл помещали в герметичный пе-нициллиновый флакон, заполненный водой, и хранили в перевернутом виде до определения.
Определение нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК. Выделение ДНК из биомассы бактерий проводили по методике, описанной ранее [11]. Для амплификации фрагмента гена 16S рРНК использовали универсальные праймеры 27f (5' - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG—3'), 1429R (5'-ACGG(Y)TACCTTGTTACGACTT—3') и 515—
533F (5'-GTGCCAGC(M)GCCGCGGTAA-3'). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на амплификаторе Терцик ("ДНК-Технология", Россия). Для получения ПЦР-фрагментов применяли следующий температурно-временной режим: начальная денатурация — 94°С, 3 мин; последующие 30 циклов - 94°С - 20 с, 55°С - 10 с, 72°С — 1 мин 30 с; конечная полимеризация — 72°С — 3 мин. Реакционная смесь (25 мкл) содержала: 1х буфер для Taq-полимеразы ("Fermentas", Литва), 10—50 нг ДНК-матрицы, по 50 мкмоль каждого дезоксирибонуклеотидтрифосфата (dNTP) ("Fermentas", Литва), по 10 пмоль соответствующих праймеров ("Синтол", Россия), 2.5 ммоль MgCl2 и 1 ед. Та#-полимеразы ("Силекс", Россия). Выделение и очистку фрагментов из агароз-ного геля выполняли с использованием набора реактивов ("Силекс", Россия) согласно рекомендациям производителя. Секвенирование ДНК проводили в Межинститутском Центре коллективного пользования "Геном" Института молекулярной биологии РАН (http://www.genome-centre. narod.ru/) с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v.3.1 ("Applied Biosystems", США) и с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 ("Applied Biosystems", США) и прилагаемого к набору протокола.
Филогенетический анализ. Предварительный анализ полученной нуклеотидной последовательности фрагмента гена 16S рРНК проводили с помощью программного пакета BLAST (http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Редактирование и выравнивание последовательностей проводили с помощью пакета программ ClustalX [12]. Филогенетическое древо было построено на основании нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК штамма BF и родственных видов рода Clostridium с помощью алгоритма "ближайших соседей" ("neibour-joining"), реализованного в пакете программ MEGA 4 [13, 14].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Наши эксперименты состояли из двух пролонгированных ферментаций, из которых первая представляла собой сопряженное отъемно-до-ливное (ОД) культивирование, а вторая ферментация осуществлялась путем регулярного пересева (РП) анаэробного сообщества на новую среду.
Сопряженная отъемно-доливная ферментация.
Осуществлялась для более глубокой переработки субстрата и накопления большего количества конечных продуктов обмена, особенно ацетата и жирных кислот, которые могут быть субстратами для фотосинтезирующих бактерий. Этот вид ферментации проводили параллельно в двух флаконах (флакон 1, флакон 2) (рис. 1). При этом из
Рис. 1. Схема установки отъемно-доливного культивирования анаэробного крахмалферментирующего микробного сообщества. 1 — флакон 1; 2 — флакон 2; 3 — сосуд для сбора газовой фракции; 4 — сосуд для сбора вытесненной воды; 5 — цилиндр для измерения объема вытесненной воды; 6 — емкость со свежей средой КМ.
флакона 2 удаляли от 50 до 100 мл культуры, вместо них добавляли такое же количество культуры из флакона 1, а во флакон 1 добавляли компенсирующее количество свежей питательной среды.
Ферментация во флаконе 1. Продолжительность ферментации анаэробного, продуцирующего водород сообщества бактерий во флаконе 1 составила 72 сут, и ее можно разделить на 3 этапа.
Первый этап продолжался 7 сут, и сообщество анаэробных бактерий росло как периодическая культура. В течение этой ферментации в среднем выделилось биогаза (смесь Н2 и С02) 1.48 л/л среды, при этом концентрация водорода в выходящем газе варьировала от 16 до 34%, а общий объем выделенного водорода сос
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.