ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2012, том 48, № 6, с. 662-667
УДК 678.07:617
ПРОЛОНГИРОВАННОЕ ВЫСВОБОЖДЕНИЕ ХЛОРАМБУЦИЛА И ЭТОПОЗИДА ИЗ ПОЛИМЕРНЫХ МИКРОСФЕР НА ОСНОВЕ
ПОЛИ-3-ОКСИБУТИРАТА
© 2012 г. Е. В. Филатова*, С. Г. Яковлев*, А. П. Бонарцев*, **, Т. К. Махина*,
В. Л. Мышкина*, Г. А. Бонарцева*
*Институт биохимии им. А.Н. Баха, РАН, Москва, 119071, e-mail: bonar@inbi.ras.ru **Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, Москва, 119992
Поступила в редакцию 26.08.2011 г.
Получены микросферы на основе поли-3-оксибутирата (ПОБ) с включением в полимерную матрицу цитостатических лекарственных веществ (ЛВ) хлорамбуцила и этопозида, изучены морфология, кинетика высвобождения ЛВ из микросфер и взаимодействие микросфер с опухолевыми клетками рака молочной железы человека линии MFC-7 in vitro. Полученные данные свидетельствуют о том, что пролонгированное высвобождение ЛВ происходит за счет диффузии лекарственного вещества из полимерной матрицы на начальном этапе и за счет гидролитической деструкции полимера на более поздних этапах. При изучении биосовместимости и биологической активности биополимерных микросфер показано, что хлорамбуцил сильнее подавляет рост культивируемых опухолевых клеток за короткое время (24 ч). Этопозид действует слабее (подавление роста клеток за 48 ч не превышает 50%), однако в дальнейшем он имеет долгий пролонгированный эффект высвобождения ЛВ из полимерной матрицы. Изучаемая система может послужить основой создания новых лекарственных форм пролонгированного действия этопозида и хлорамбуцила для терапии онкозаболеваний.
Современное состояние химиотерапии для лечения онкологических заболеваний указывает на необходимость улучшения терапевтической эффективности противоопухолевых средств. Современный цитостатический препарат должен отвечать следующим требованиям: обладать высокой эффективностью при постоянной заранее заданной концентрации в опухоли и, в то же время, проявлять низкую системную токсичность и большую продолжительность действия. Для достижения этих условий возможно создание мак-ромолекулярных терапевтических систем с контролируемым высвобождением ЛВ, то есть создание коньюгатов лекарственных препаратов с полимерным носителем.
В качестве полимерного носителя в своей работе мы использовали поли-3-оксибутират — био-разлагаемый термопластик, обладающий хорошей биосовместимостью и способностью полностью разлагаться в организме человека до СО2 и воды [1—3]. К настоящему времени разработаны технические условия и регламент получения медицинского поли-3-оксибутирата (ПОБ), показано, что полимер поли-3-оксибутират нетоксичен, не обладает раздражающим и сенсибилизирующим действием, отвечает требованиям нормативной документации при фармацевтическом использовании и применим для парентерального и перо-рального применения [3, 4]. Поли-3-оксибутират активно используется для создания и исследова-
ния систем пролонгированного высвобождения широкого спектра лекарственных веществ (ЛВ) [5, 6]. Постепенное высвобождение ЛВ из биополимерной матрицы обеспечивает длительное поддержание необходимой концентрации действующего вещества в организме или локально в определенном органе, или ткани. Тем самым, устраняется необходимость дополнительного многократного введения ЛВ, снижается его токсичность и побочные эффекты, повышается стабильность ЛВ и его эффективность за счет равномерной скорости подачи. Это является особенно актуальным для препаратов, применяемых в он-котерапии, так как они обладают высокой токсичностью и вызывают ряд тяжелых осложнений у пациентов.
При создании систем контролируемого высвобождения ЛВ мы использовали два противоопухолевых препарата — Хлорамбуцил и Этопозид. В традиционных лекарственных формах они вызывают ряд осложнений [7], поэтому целесообразно использование пролонгированных лекарственных форм этих препаратов. Использование биосовместимых полимеров, например поли-3-оксибутира-та, в качестве основы для таких форм, могло бы не только устранить многие недостатки использования традиционных лекарственных форм онко-препаратов, но и позволило бы контролировать количество и время высвобождения ЛВ. Ранее нами было показано, что путем варьирования моле-
кулярной массы ПОБ и размера полимерных частиц также можно влиять на скорость высвобождения ЛВ из полимерной основы ПОБ [8—10].
Цель работы — получение и исследование свойств пролонгированных лекарственных форм хлорамбуцила и этопозида, создание биополимерных микросфер на основе поли-3-оксибутирата, содержащих цитостатическое ЛВ — хлорамбуцил или этопозид; исследование кинетики выхода ЛВ из микросфер, изучение биосовместимости и их биологической активности на культуре клеток in vitro.
МЕТОДИКА
Материалы. Для получения биополимерных микросфер в работе использовали поли-3-окси-бутират (Мм 236 кДа), полученный микробиологическим путем. В качестве продуцента ПОБ был использован штамм Azotobacter clorococcum 7Б
[10]. Использованы: ЛВ — хлорамбуцил и этопозид ("Sigma", Германия), хлороформ ("Экос-1", Россия), поливиниловый спирт ("MP Biomedicals", США).
Получение поли-3-оксибутирата. Использовали штамм-продуцент ПОБ A. chroococcum 7Б, способный синтезировать до 80% ПОБ от сухой массы клеток. Для достижения сверхсинтеза ПОБ культуру A. chroococcum выращивали на среде Бер-ка в условиях избыточного содержания источника углерода (г/л): MgSO4 • 7H2O - 0.4; FeSO4 • 7H2O -0.01; Na2MoO4 • 2H2O - 0.006; цитрат Na - 0.5; CaCl2 - 0.1; K2HPO4 • 3H2O - 1.05; KH2PO4 - 0.2; сахароза - 40; в течение 48 ч в аэробных условиях при 28°C. Выход сухой биомассы составлял 10 г/л среды. Содержание полимера в клетках A. chroo-coccum - 76% от сухой массы клеток.
Выделение и очистка полимера из биомассы A. chroococcum включали растворение ПОБ в хлороформе путем встряхивания на качалке при 37°C в течение 12 ч, отделение раствора ПОБ от клеточных остатков фильтрованием, выделение ПОБ из раствора хлороформа осаждением изопропило-вым спиртом. После трехкратного перерастворения ПОБ в хлороформе и осаждения изопропано-лом очистку завершали высушиванием полимера на воздухе при 60°C. Молекулярную массу полимера определяли методом вискозиметрии: вязкость раствора ПОБ в хлороформе измеряли при 30°C в вискозиметре "RT RHEOTEC" ("RheoTec", Германия). Молекулярную массу вычисляли по уравнению Марка-Хаувинка-Куна, используя следующие коэффициенты [п] = 7.7 х 10-5М0 82, где п - вязкость, М - молекулярная масса ПОБ
[11].
Получение микрочастиц из ПОБ. Микросферы были получены с помощью метода одноэтапного эмульгирования раствора ЛВ с ПОБ в хлорофор-
ме с последующим испарением растворителя [10]. Этот метод был адаптирован для инкапсулирования хлорамбуцила и этопозида. Раствор Л В и ПОБ с молекулярной массой 236 кДа в соотношении 1 : 4 в 8 мл хлороформа постепенно добавляли к 100 мл поливинилового спирта в дистиллированной воде с концентрацией 1.5% масс./об. при перемешивании. Перемешивание проводили в течение 2 ч при помощи механической верхнеприводной мешалки RZR 2021 ("Heidolph", Германия) при 1000 об/мин. После полного испарения органического растворителя микросферы отделяли центрифугированием (6 мин при 3000 g), центрифуга 5702 R ("Eppendorf", Германия), затем 3 раза промывали дистиллированной водой для полного удаления эмульгатора и ЛВ с поверхности сфер. Микросферы высушивали в термостате при 37°С.
Определение размера микросфер из ПОБ и содержания в них ЛВ. Средний диаметр у полученных партий микросфер определяли по микрофотографиям, полученным с помощью светового микроскопа Биомед 1 Вар. 2 ("Биомед", Россия) с цифровым окуляром MYscope 300M ("Webbers", Тайвань).
Содержание хлорамбуцила и этопозида в микросферах определялось спектрофотометрически после их растворения в хлороформе путем измерения поглощения света на спектрофотометре DU-650 ("Beckman Coulter", США) (максимумы поглощения при 259 и 305 нм для хлорамбуцила и 288 нм для этопозида) при сравнении с контрольным раствором ПОБ в хлороформе и с помощью построения калибровочной кривой с использованием растворов в хлороформе ПОБ и ЛВ в различных концентрациях.
Кинетика высвобождения ЛВ из микросфер на основе ПОБ. Эксперимент по высвобождению хлорамбуцила и этопозида из микросфер in vitro проводили при 37°С в термостате TC-1/80 СПУ ("Лабтех", Россия) в 25 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7.4) с небольшим добавлением эмульгатора (0.05% Triton X-10 по объему): 4 партии по 20 мг микросфер в 4 мл буфера перемешивали на шейке-ре ("BioSan", США) при 330 об/мин. Через определенные промежутки времени (через 1, 2, 3 ч и т.д.) микросферы отделяли от буфера центрифугированием при 14100 g на центрифуге MiniSpin Plus, ("Eppendorf", Германия) и добавляли 4 мл свежего буфера. Содержание ЛВ в буфере определяли на спектрофотометре DU-650 ("Beckman Coulter", США) с помощью построения калибровочной кривой с использованием водных растворов ЛВ в различных концентрациях. Остаточное содержание ЛВ в микросферах определяли также спектрофотометрически, растворяя их в хлороформе.
Рис. 1. Микрофотографии полученных микрочастиц (электронная микроскопия): хлорамбуцил (а); этопозид (б).
Микроскопия. Первичное изучение свойств микрочастиц и их морфологии проводилось с помощью световой микроскопии (микроскоп Био-мед 1 Вар. 2 ("Биомед", Россия) с цифровым окуляром MYscope 300M ("Webbers", Тайвань)). Микрофотографии микрочастиц были получены методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) в электронном и ионном излучениях (микроскоп FEI-SMA-QUANTA 200, и SMA QUANTA FEG, "FEI Company", США).
Взаимодействия микросфер с культурой клеток in vitro. Для оценки биобезопасности микросфер in vitro использовали культуру клеток рака молочной железы человека линии MCF-7. Клетки культивировали с использованием методов, описанных Фрешни [12]. Выживаемость клеток под влиянием тестируемого агента вычисляли по формуле (1), где S — выживаемость клеток, Ыоп — количество живых клеток в опыте, ^контр — кол-во живых клеток в контроле.
5 =
Nn
N
■X 100%.
(1)
контр
При этом применялся стандартный МТТ-тест (с испо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.