УДК 577.112.(012.6+088.52):593.6-117.62
ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА ДИМЕРНОЙ ФОРМЫ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ВАРИАНТА ЗЕЛЕНОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО БЕЛКА EGFP-K162Q В КРИСТАЛЛИЧЕСКОЙ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ГРУППЕ P61
© 2014 г. Н. В. Плетнева*, #, С. В. Плетнев**, А. М. Богданов*, Е. А. Горячева*, И. В. Артемьев*, Е. А. Суслова*, С. Ф. Архипова*, В. З. Плетнев*, #
*ФГБУНИнститут биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
117997, Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 **Центр синхротронного излучения, Национальный институт рака, Аргонн, Иллинойс, США Поступила в редакцию 20.12.2013 г. Принята к печати 29.01.2014 г.
Методом рентгеноструктурного анализа установлена пространственная структура димерной формы зеленого флуоресцентного белка EGFP-K162Q с С-концевой делецией МБЕЬУК (БОБРу) в кристаллической пространственной группе Р61 при разрешении 1.34 А. Результаты сопоставлены с данными рентгеноструктурных исследований мономерной формы БОБР (зеленого биомаркера с улучшенными фотофизическими свойствами) в другой кристаллической группе Р212121 при разрешении 1.50 и 1.35 А [1, 2]. Субъединицы в димерной структуре БОБРу располагаются под углом 75° с площадью контакта ~800 А2. Димерное образование стабилизируется шестью водородными связями и центральным гидрофобным ядром из шести остатков. Среднеквадратичное отклонение Са-атомов аминокислотных остатков 3—230 в кристаллических структурах Р6х и Р212121 составляет 0.55 А. Отличительной особенностью структуры ЕОБРу-Р6х, по сравнению с БОБР-Р212121, является заметно иная ориентация боковой цепи 01и222, а также новая конформация петлевого участка 155—159 с отклонениями между Са-атомами совмещенных структур, достигающими у Ьуз156 — 4.6 А и у Ьуз158 — 5.5 А.
Ключевые слова: ОРР подобные белки, ЕОРР, зеленый флуоресцентный белок, хромофор, пространственная структура, рентгеноструктурный анализ.
БОТ: 10.7868/80132342314040101
ВВЕДЕНИЕ
Флуоресцентные GFP-подобные белки (green fluorescent protein) из морских организмов нашли широкое применение в молекулярной и клеточной биологии, биотехнологии и биомедицинских исследованиях в качестве генетически кодируемых молекулярных инструментов для мечения белков, клеточных компартментов, клеток и тканей [3—5]. Пространственная структура этих белков имеет общую форму в-бочонка, сформированного из 11 антипараллельных в-тяжей и одной центральной спирали, в центре которой располагается хромофор. Хромофор образуется в результате автокаталитической посттрансляционной модификации трeх аминокислотных остатков -X-Tyr-Gly- без участия каких либо кофакторов или ферментов, за исключением молекулярного кислорода. Знание механизма образования хромофора, его структуры и аминокислотного окружения
#Авторы для связи (тел.: +7 (495) 330-75-10, эл. адрес: vzpletnev@gmail.com, nadand@mail.ru).
позволяет с помощью мутагенеза создавать улучшенные варианты белков, удовлетворяющие критериям, требуемым для практических целей.
Один из широко используемых в практике биомаркеров — генно-инженерный зеленый флуоресцентный белок EGFP был получен из GFP-белка дикого типа медузы Aequorea victoria путем двух ключевых аминокислотных замен — первого остатка хромофора Ser65 на Thr [6] и предшествующего остатка Phe64 на Leu [7]. По сравнению с природным аналогом, он обладает улучшенными спектральными свойствами, фотостабильностью и повышенной скоростью сворачивания белка в нативную структуру (фолдингом) при 37°C.
В настоящей работе представлены результаты рентгеноструктурного исследования димерной формы зеленого флуоресцентного белка EGFP-K162Q с С-концевой делецией MDELYK (EGFPv) в кристаллической пространственной группе P61 при разрешении 1.34 Á (рис. 1). Исследуемый генно-инженерный вариант EGFPv получен в лаборато-
1 10 20 30 40
ЕОЕРУ_Р61
2У0О_Р212121
4ЕиЬ_Р212121
—МКС Б НННННН С БV ЭКвЕ Е Ь Е Т вЭТРI1Л/ЕЬОбБУЫСНКЕ Э V ЭвБвЕвОАТУСКЬТ ЬКЕ МАННННННСННН0ЬУЗКСЕЕЪЕТСУУР1ЬУЕЬ0С0УШНКЕЗУЗСЕСЕ60АТУСКЬТЬКЕ -------------МУ5КСЕЕЬЕТС\^Р1Ь¥ЕЬ0С0таСНКРЗУЗСЕСЕС0АТУСКЬТЬКЕ
ЕОЕРУ_Р61
2У0О_Р212121
4ЕиЬ_Р212121
50 60 70 80 90 100
111111
1СТТСКЬРУРИРТЪУТТЬТУОУ0СЕЙЕУРОНМК0НОРЕКЙАМРЕОУУ0ЕНТ1ЕЕКООСНУ 1СТТСКЬР'УРМРТЬ'УТТЬТУ6У0СЕЗНУР0НМКСН0ЕЕКЗАМРЕ6У'У0ЕКТ1 ЕЕКЭОСНУ
1СТТСКЬРУРИРТЪУТТЬТУОУ0СЕЙЕУРОНМК0НОРЕКЙАМРЕОУУ0ЕНТ1ЕЕКООСНУ ************************************************************
120 120 130 140 150 160
||||| $$$$$| #
ЕОЕРУ_Р61 КТКАЕУКЕЕСОТЬУНК1ЕЬКСЮЕКЕОСН1ЬСНКЬЕУЫУЫ5ННУУ1МАОК0КМС1С'*/ЫЕК
2У0О_Р212121 КТЕАЕУКЕЕСОТЬ™Е1ЕЬКСЮЕКЕОдЫ1ЬвНКЬЕУНУНЗНЫУУ1МАОК0КЫд1К™ЕК 4ЕиЬ_Р212121 КТЕАЕУКЕЕСОТЬ™Е1ЕЬКСЮЕКЕОдЫ1ЬвНКЬЕУНУНЗНЫУУ1МАОК0КЫд1К™ЕК
******************************************************* ф ****
170 180 190 200 210 220
I I I | & | |& &
ЕОЕРУ_Р61 1КНЫ1Е0СЗУ(2ЬА0НУ00МТР160СР'УЬЬР01\1НУЬЗТ03АЬЗК0РЫЕКЕ0НМ'УЬЬЕЕУТА
2У0О_Р212121 1КНЫ1ЕОС5У0ЬАОНУ00НТР1СОСР'УЬЬРВЫНУЬЗТ<23АЬЗКОРЫЕККОНМ'\/ЪЬЕЕУТА
4ЕиЬ_Р212121 1КНЫ1Е0СЗУ(2ЬА0НУ00ЫТР1С06Р'УЬЬР0ЫНУЬЗТ03АЬЗК0РЫЕКЕ0НМ'УЬЬЕЕУ,ТА
************************************************************
ЕОЕРУ_Р61
2У0О_Р212121
4ЕиЬ_Р212121
230
I
Ав1ТЬС------
АС1ТЬСМОЕЬУК
АИТЬСМОЕЬУК ******
Рис. 1. Выравнивание аминокислотных последовательностей исследуемой структуры ЕОБРу, генно-инженерного варианта БОБР с заменой K162Q (#) и делецией С-концевой части МВЕЬУК (пространственная группа Р61, РВВ_1В: 4N3D) и БОБР (пространственная группа Р212121, РВВ_1В: 2У00 и 4ЕЦЬ). Обозначения: & — гидрофобное ядро на интерфейсе димерной структуры, образованное триплетами А1а206, Ьеи221 и РИе223 от двух субъединиц А и В; $ — конформационно вариабельный участок Ар155-Ьу8156-О1п157-Ьу8158-АБп159.
рии биофотоники Института биоорганической химии РАН (ИБХ РАН, Москва) для изучения окислительной фотоконверсии ОБР-подобных белков (неопубликованные данные). Его спектральные характеристики практически идентичны таковым БОБР — ^абс = 488 нм, ^эм = 510 нм.
Работа явилась продолжением рентгенострук-турных исследований мономерной формы БОБР в другой кристаллической группе Р212121 при разрешении 1.50 и 1.35 А [1, 2]. Полученные данные позволили детализировать отдельные особенности пространственной организации БОБР/БОБРу. Особое внимание в работе было обращено на сте-реохимическую организацию интерфейса в димерной структуре БОБРу.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Структура мономера. Пространственная структура мономера БОБРу имеет форму стандартного Р-бочонка, сформированного из 11 антипараллельных Р-тяжей и одной центральной спирали, в центре которой располагается хромофор. Положение хромофора ТЬг65-Туг66-О1у67 стабилизируется водородными связями (как прямыми, так и опосредованными через молекулы воды) и гидрофобными взаимодействиями с 23 а.о. ближайшего окружения хромофора (в пределах ~ 4 А; рис. 2). Пространственная структура мономера БОБРу_Р61 в целом близка структурам белка, установленным для кристаллической упаковки БОБР_Р212121 ^Б_ГО: 2У0О, 4БиЬ [1, 2]). Среднеквадратичное отклонение Са-атомов
Asn121 ..-О
^Vali1
,, О XV,.... ^ Tyr92
- Ч -
.. "j Val68 M (-у
4 ^Л Л
О •■^L 3.° 29Ч# V-'ö Gln69
Thr62
Leu42
Leu64
Leu22° *
OJ
Val61;,
Glu222
44
Leu44p 0 2.8 -OW W
Gln94
29 л
2.9 2.8 J.i |Val15°
W
■ -■■ Г, W 2.7' ^
2.8
er2°5
2.9 2.9
ASn146 Thr2°3 Ь
2.9 ■- ■„ ^у | Phe165 Arg96
Ile167
^ Туг145
ТЪг203
Рис. 2. Аминокислотное окружение хромофора. Н-Связи (<3.3 А) показаны прерывистыми линиями, ван-дер-вааль-совы контакты (<3.9 А) — "ресничками" (рисунок получен с помощью программы ЫОРЮТ/НВРЬиБ [20].
остатков 3—230 для структур в пространственных группах Р61 и Р212121 составило ~0.55 А.
Отличительной особенностью структур бобру_р61 и БОБР_Р212121 (рис. 1) является наличие двух альтернативных конформаций боковой цепи каталитического остатка 01и222 (рис. 3). Одно из них соответствует положению боковой цепи, наблюдаемому в мутанте ОБР_865Т (РЭВ_ГО: 1БМА [8]), и сильно отличается от такового в белке дикого типа wtGFP (РЭВ_ГО: ШБЬ [9]). Второе, менее заселенное конформационное состояние боковой цепи 01и222 (коэффициент заполнения ~0.3—0.4), у всех трех структур несколько различается. В структуре бобру_р61 боковая цепь 01и222 в обеих конформациях образует водородные связи с гидроксильной группой ТЪг65 хромофора, стабилизируя его ориентацию (рис. 3). Соответствующие величины расстояния (О1и222)С=0...0Н(Ткг65) и угла (01и222)С=0-0(ТИг65) для одной из конформаций равны соответственно 2.9 А и 112°, для другой - 2.4 А и 131°. Эта структурная особенность была найдена определяющей в наблюдаемом эф-
фекте улучшения спектральных свойств GFP_S65T мутанта по отношению к wtGFP [6].
Вторая существенная замена F64L в GFP_S65T привела к заметному ускорению сворачивания белка в нативную структуру (фолдинга) вследствие предполагаемой оптимизации упаковки гидрофобного ядра, примыкающего к хромофору [2]. Данное ядро является конечным продуктом фолдинга белка и, по нашему мнению, не может быть движущим фактором динамики процесса формирования пространственной структуры. Более предпочтительным представляется механизм на основе теории генетического стереохимического кода [1°—12]. По этому механизму сворачивание полипептидной цепи белка в нативную структуру идет через селективное образование временных комплементарных связей между отдельными аминокислотными остатками. Здесь роль стери-ческого фактора замены остатка Phe на конфор-мационно более подвижный Leu может быть весьма значительной.
Наиболее существенное различие структур EGFPv_P61 и EGFP_P212121 относится к конфор-
Рис. 3. Стереоизображение информационных состояний боковой цепи каталитического остатка О1и222 в структурах димера БОБРу_Рб1 (РВВ_ГО: 4№В; атомы углерода показаны светлым цветом), мономеров БОБР_Р2^21 (РВВ_ГО: 4БиБ и 2У0О; атомы углерода показаны черным и темно-серым цветом, соответственно). Рисунок получен с помощью программы РУМОБ [21].
Рис. 4. Стереоизображение конформационного состояния петлевого участка 155—159 в димерной структуре БОБРу-Р61 (атомы углерода показаны светлым цветом) и в мономерной структуре БОБР-Р212121 (атомы углерода показаны темно-серым цветом).
мационному состоянию на петлевом участке
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.