БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 9, с. 659 - 674
УДК 547.963.02.543.422.25:577.322.523
ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА ТРАНСМЕМБРАННЫХ СЕГМЕНТОВ С, Е И в БАКТЕРИООПСИНА ПО ДАННЫМ ДВУМЕРНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ ^-ЯМР
© 1995 г. И. В. Масленников*, Э. В. Бочаров, А. С. Арсеньев
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117871, Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 28.12.94 г.
По данным двумерной спектроскопии 'Н-ЯМР рассчитана пространственная структура синтетических пептидов, аналогов трансмембранных сегментов С (остатки 67 - 106), Е (128 - 162) и С (190 - 233) бактериоопсина На1оЬаЫегшт Иа1оЫит, солюбилизированных в смеси метанол-хлороформ (1 : 1) с 0.1 М 1лСЮ4. Сегмент С образует правую а-спираль на участке Рго77 - Уа1101. Остаток Рго91 в середине а-спирали индуцирует ее "излом" на 25°. Сегмент Е образует правую а-спираль на участке Уа1136 - 8ег158. Сегмент в имеет а-спиральный участок, начинающийся с СО-группы 11е198 и заканчивающийся №*Н-группой Аг§227. Величины торсионных углов боковых цепей х' однозначно определились для большинства аминокислотных остатков а-спиральных участков. Конформации боковых цепей некоторых аминокислотных остатков трансмембранных сегментов бактериоопсина в растворе отличаются от определенных ранее по данным электронной микроскопии. Уточнены конформации участков, терминирующих а-спирали сегментов С и Е.
Ключевые слова: бактериородопсин; белки, пептиды, ЯМР; структуры - вторичная, пространственная.
Бактериородопсин (БР) - основной белок пурпурных мембран На1оЪас1епит каЬЫит. В его состав входит 248 аминокислотных остатков и рети-наль, связанный через шиффово основание с е-аминогруппой Ьу8216 [1]. Этот сравнительно небольшой (26 кДа) белок функционирует как светозависимый протонный насос, преобразующий энергию солнечного света в хемиосмотичес-кий потенциал [2 - 4].
Изучение механизма функционирования БР взаимосвязано с установлением его пространственной организации. В настоящее время наиболее; полная модель пространственной структуры БР получена по данным электронной криоми-кроскопии (ЭКМ) [5]. Достигнутое разрешение (3.5 А в плоскости мембраны и 10 А в перпендикулярной плоскости) позволило соотнести аминокислотную последовательность БР со схемой укладки полипептидной цепи в пространстве и
Сокращения: БР - бактериородопсин; БО - бактериоопсин; Nie - норлейцин; sC, сегмент С - [Nle68]BO-(67 - 106)-поли-пептид; sE, сегмент Е - [1Ч1е145]БО-(128 - 162)-полипептид; sG, сегмент G - [Nle209]BO-(190 - 233)-полипептид; ЭКМ -электронная криомикроскопия; F, РЯэо ~~ штрафная функция, зависящая от разности экспериментальных и теоретически рассчитанных из расстояний между протонами и величины времени релаксации значений ЯЭО.
* Автор для переписки.
определить границы а-спиральных участков трансмембранных сегментов. Однако разрешения ЭКМ недостаточно для выяснения тонких деталей пространственного строения БР (точные границы а-спиральных участков, конформации боковых цепей аминокислотных остатков, взаимодействие между спиральными участками и т.д.). Остается также под вопросом соответствие полученной Хендерсоном с соавт. [5] структуры реальному состоянию БР в мембране.
Ранее было показано [6], что солюбилизиро-ванный в смеси хлороформ-метанол БР сохраняет вторичную структуру, соответствующую на-тивному белку, и обладает специфической третичной структурой. Индивидуальные фрагменты БР, выделенные после расщепления полипептидной цепи, также сохраняют в этой смеси органических растворителей конформацию, характерную для фрагментов интактной молекулы [7-10]. На основании этих наблюдений предложена схема "модульной сборки" пространственной структуры мембранных белков по данным спектроскопии ЯМР [6].
К настоящему времени проведен анализ данных ЯМР и рассчитаны пространственные структуры протеолитических фрагментов ВР2 (остатки 163 -231, соответствующие трансмембранным спиралям Б и в) [11] и С2 (остатки 1-71,
спирали А и В) [8, 9], фрагмента А (остатки 1 - 36) [10], синтетического аналога трансмембранного сегмента В (остатки 34 - 65) [12, 13], солюбилизи-рованного в смеси хлороформ-метанол, а также фрагмента А (1 - 36) [10] и синтетического аналога сегмента В [ 14], встроенных в мицеллы доде-цилсульфата натрия. По данным спектроскопии 'Н-ЯМР охарактеризованы конформации трансмембранных сегментов С, Е, О [15] и И [16], солю-билизированных в смеси хлороформ-метанол.
В настоящей работе на основе интегральных иитенсивностей кросс-пиков в двумерных спектрах ЯЭО, полученных ранее [15], проведен расчет пространственной структуры трансмембранных сегментов вС (остатки 67 - 106), вЕ (128 - 162) и ев (190'- 233) бактериоопсина, солюбилизиро-ванных в смеси хлороформ-метанол (1 : 1) с 0.1 М 1лСЮ4. Проведен сравнительный анализ определенных по данным спектроскопии 'Н-ЯМР структур трансмембранных сегментов БР в различных средах, моделирующих мембранное окружение (смесь хлороформ-метанол, мицеллы БОБ) [7 -16], с ЭКМ-структурой БР [5].
Реконструкция пространственной структуры трансмембранных фрагментов бактериоопсина, проведенная после анализа вторичной структуры пептидов [15], включала в себя следующие основные этапы.
Анализ локальной структуры. Методика такого анализа по данным спектроскопии ЯМР с использованием программы СОКТСЖЫМК была отработана ранее [17, 18] и применительно к трансмембранному сегменту В бактериоопсина подробно описана в работе [13]. Времена корреляции движения межпротонных векторов (тс) были определены для 9 остатков молекулы вС (диапазон значений 3 - 6 не), 8 остатков вЕ (2 - 6 не) и 12 остатков (5 - 7 не), у которых зависимость штрафной функции ЯЭО от тс (Р(тс)) имеет выраженный минимум в указанных интервалах. В дальнейших расчетах время корреляции для 5С и эЕ принято равным 4 не, а для хС - 6 не. Для многих пептидных единиц исследованных молекул минимум зависимостей Е(тс) оказался плохо выраженным из-за недостаточного числа измеренных объемов внутри-остаточных кросс-пиков ЯЭО или существенной погрешности их измерения.
Ограничения на торсионные углы основной цепи ф и необходимые для конструирования стартовых конформаций молекул, находили исходя из зависимостей штрафных функций РЯЭо(ф. V) (кон-формационные карты), используя полученное время тс. Результаты анализа локальной структуры показали, что конформации основной цепи сегментов БО характеризуются определенными диапазонами значений торсионных углов ф и у, соответствующими низкоэнергетическим областям К, В или О конформационной карты. Для
всех остатков sC начиная от Тгр80 до Val 101, sE от Arg 134 до Phel56 и sG от Val 199 до Arg227 определились области R или Q, что согласуется со сделанными ранее выводами о наличии здесь а-спи-ральных участков [15]. Для остатков глицина, а также Thr67, Leu94 (sC), Ser 162 (sE) и Uel91 (sG) из-за недостатка экспериментальных данных не удалось определить диапазоны углов ф и vj/. В таких случаях рассматривали весь диапазон стериче-ски разрешенных значений торсионных углов основной цепи. Количество ограничений на углы основной цепи, определенных путем анализа локальной структуры sC, sE и sG, приведено в табл. 1.
Расчет пространственной структуры трансмембранных сегментов бактериоопсина проводился с помощью программы DIANA [19]. В качестве входных данных для предварительного расчета использовали ограничения сверху на межпротонные расстояния, оцененные по объемам кросс-пиков в спектре NOESY с помощью калибровки "1 /г6" [11], и ограничения на торсионные углы, найденные при анализе локальной структуры. Полученные в результате наборы из 100 структур для каждого сегмента использовались для определения системы водородных связей и в качестве начальных структур для расчета ограничений на межпротонные расстояния по программе анализа матрицы релаксации MARDIGRAS [20].
Ограничения сверху на межатомные расстояния OO...HN (22 пм) и OO...N (32 пм) водородных связей вводились для медленно обменивающихся амидных протонов в тех случаях, если соответствующие им расстояния CO...HN < 30 пм были обнаружены больше чем в 50 структурах из 100, полученных в результате предварительного расчета.
После расчета по программе DIANA с учетом ограничений на водородные связи и более точных ограничений сверху и снизу, определенных с использованием программы MARDIGRAS, получены наборы из 20 структур для sC, sE и sG, которые хорошо удовлетворяют экспериментальным данным. Количество использованных экспериментальных данных (ограничения на расстояния и углы) и оценка результатов расчета структур с помощью дистанционного алгоритма приведены в табл. 1.
Систематический поиск конформаций боковых цепей и оценка возможности реализации ротамеров боковой цепи для каждого остатка проводились на участках с хорошо определившимся ходом полипептидной цени. При этом в качестве стартовой использовали одну из структур сегмента, полученных на предыдущем этапе с помощью программы DIANA. Процедура систематического поиска конформации боковых цепей с использованием программы CONFORNMR подробно описана в работе [13], а полученные для молекул sC, sE и sG результаты приведены в табл. 2 - 4. На данном этапе были установлены
Таблица I. Экспериментальные данные, результаты расчета иланализ полученных наборов пространственных структур для полипептидов вС, и яС бактериоопсина
Параметр sC (67 - 106) sE (128 - 162) sG (190-233)
Количество ограничений для на расстояния по ЯЭО* 460 376 408
программы DIANA на водородные связи 48 48 50
на углы ф и \|/ 2* 68 66 74
Время корреляции2*, не 4 4 6
Результаты штрафная функция, А2 1.9 1.3 0.9
расчета по сумма нарушений ограничений верхних, нм 0.48 0.28 0.18
программе DIANA Ww3*, нм 0.16 0.09 0.08
углов, град 12.5 11.0 6.0
а-спиральный участок, остатки 78 - 101 135 - 158 198 -227
структурированный участок, остатки 76-101 131 - 158 198 - 227
Однозначно определена для числа остатков 9 13 19
конформация боковой цепи . % 45 65 73
Конформационная э нергия4*, ккал/моль -140 -128 -176
Среднее для набора ЯМЗО для тяжелых атомов, ±2 пм 36 27
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.