ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2007, том 62, № 11, с. 1155-1161
^=ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 543.544
ПРОСТЫЕ ЭЛЮЕНТЫ ДЛЯ ФОРМИРОВАНИЯ восходящих ГРАДИЕНТОВ рН В ХРОМАТОФОКУСИРОВАНИИ БИПОЛЯРНЫХ
СОЕДИНЕНИЙ
© 2007 г. М. С. Вакштейн, А. В. Иванов
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет
119992 Москва, ГСП-2, Ленинские горы Поступила в редакцию 18.06.2006 г.
Изучено формирование восходящих градиентов рН в карбоксильных колонках при использовании элюентов простого состава (1-2 компонента). Полученные градиенты сравнимы в широком диапазоне рН с градиентами, сформированными при использовании синтетического полиамфолитного элюента "Полибуфер-96". Наиболее плавные, практически линейные градиенты рН формируются при создании ионной силы 0.05-0.5 в одной или обеих подвижных фазах - стартовом растворе и элюенте. Возможности аналитического применения простых элюентов в хроматофокусировании показаны на примере разделения модельной смеси белков и изоформ формиатдегидрогеназы.
Хроматофокусирование - вариант ионообменной хроматографии в сочетании с градиентом рН, формируемым внутри колонки, разработанный Слайтерманом в 1978-1979 гг. для разделения биполярных веществ (белков, ферментов, пептидов) [1]. Для создания внутреннего градиента рН колонку предварительно уравновешивают стартовым буферным раствором до рН, соответствующего начальной точке градиента, а затем пропускают буферный элюент (как правило, раствор высокомолекулярного амфолита) при резко отличающемся рН. Сорбент также должен обладать буферирующей способностью, т.е. быть слабоосновным или слабокислотным. В результате в слое сорбента внутри колонки создается практически линейный, плавный градиент рН: в анионо-обменной системе формируют нисходящие, а в катионообменной - как правило, восходящие градиенты [2-4]. Внутренние градиенты хорошо воспроизводимы и могут быть линейными в интервале до 4-5 ед. рН [1]. Биполярные вещества разделяются в условиях градиента pН в соответствии с их изоэлектрическими точками (р1). Так, достигнуто разделение компонентов, у которых pI отличаются на 0.05 ед. рН [2]. Хроматофокусирование сейчас широко используют в биохимическом анализе и в препаративных целях - например, при очистке белков или разделении ферментов [2, 3, 5].
Основные ограничения хроматофокусирова-ния связаны с недостатками полиамфолитных элюентов - т.н. "полибуферов". Синтетические полиамфолитные элюенты - "Polybuffer", "Ви£Га-1у;е", '^егуа1уе", "Pharmalyte" и др. - легко подвергаются биодеградации под действием бактерий; из-за высокого собственного светопоглощения затрудняют УФ-детектирование неароматических
пептидов ниже 254 нм. Синтез полиамфолитов достаточно сложен и дорог. Кроме того, в ряде случаев при препаративном разделении белков требуется последующая очистка компонента от полибуферного элюента [6]. Замена синтетических полиамфолитных элюентов на многокомпонентные (до 20-30 простых компонентов) буферные смеси слабых кислот, оснований и амфоли-тов позволила получать плавные линейные градиенты в широком диапазоне рН [7-9]. Однако распространения данный подход не получил -главным образом, из-за того, что выбор и составление подобных смесей очень трудоемко, а стоимость многокомпонентного элюента в результате может превышать стоимость коммерческого "Полибуфера" [10].
Фрею и соавторам удалось сформировать плавные внутренние градиенты в ограниченном диапазоне рН с использованием элюентов, состоящих не более чем из 3-5 компонентов [10, 11]. В наших предыдущих работах мы показали, что для создания плавных нисходящих градиентов можно успешно применять однокомпонентные элюенты в сочетании с добавками сильного электролита [12-14]. Однако для формирования восходящих градиентов рН по-прежнему актуален поиск более простых элюентов. Выбору таких элюентов и их возможному применению в хроматофокусировании и посвящена данная статья.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Аппаратура. Использовали хроматографиче-скую систему, включающую насос высокого давления K-120 (Knauer, Германия) или LC-10 AT (Shimadzu, Япония); инжектор (Knauer, Германия)
1155
3*
с объемом петли 20-100 мкл; хроматографиче-скую колонку (50 х 4.6 мм), заполненную сорбентом MacroPrep 50 CM или MN; спектрофотомет-рический детектор MicroUvis 20 (Carlo Erba Instruments, США); цифровой рН-метр HM-20S (TOA Electronics, Япония) с комбинированным стеклянным электродом GST-5211C и проточной ячейкой. Сигналы регистрировали с помощью программы "Мультихром 1.52" (Амперсенд, Россия).
Сорбенты. Использовали: а) MacroPrep 50 CM (BioRad, США) на основе полиметилметакрилата с карбоксиметильными группами, размер частиц 50 мкм, ионообменная емкость (по данным производителя) 0.21 х 0.04 ммоль/мл геля; матрица гидролитически устойчива при рН от 2-3 до 13; б) MN (Purolite, Великобритания) на основе сверх-сшитого полистирола с карбоксильными группами, размер частиц 5 мкм, матрица устойчива при рН 1-13. Данные по ионообменной емкости производителем не указаны.
Реагенты и растворы. В качестве компонентов стартовых растворов использовали уксусную, щавелевую, винную, лимонную кислоты (Реахим, Россия) и Трис (Merck, Германия), в качестве элю-ентов - 1 : 10-1 : 25 растворы "Полибуфера-96" (Pharmacia, Швеция), растворы Трис и лимонной кислоты. Необходимую кислотность растворов "Полибуфера-96" или Трис создавали добавлением HCl. Для создания ионной силы в подвижных фазах добавляли рассчитанное количество 2 М раствора NaCl, приготовленного из фиксанала (Germed, ГДР). Все используемые реактивы имели квалификацию ч.д.а. Модельную смесь белков (по 0.02 мг) готовили из препаратов, предоставленных проф. А.П. Синицыным (кафедра химической эн-зимологии МГУ). Образец формиатдегидрогена-зы (ФДГ) с активностью 1 мг/мл предоставлен профессором той же кафедры В.И. Тишковым.
Методика эксперимента. Пропускали стартовый раствор при рН 2.7-3.3 до уравновешивания колонки (т.е. до совпадения рН на входе и выходе колонки) и установления постоянной базовой линии УФ-детектора, а затем меняли стартовый раствор на элюент (рН 7.0-7.6) и регистрировали рН эффлюента в проточной ячейке. При разделении модельной смеси белков или образца ФДГ в колонку вводили 10-50 мкл при рН стартового раствора и одновременно регистрировали сигналы pН-мет-ра и УФ-детектора (при 280 нм). Объемная скорость подвижных фаз составляла 1 мл/мин.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для разделения биполярных соединений на ка-тионообменных сорбентах необходимо использовать восходящие градиенты p^ так как биполярные соединения в кислой среде (при pН ниже их значений pI) заряжены положительно и могут
сорбироваться на катионообменнике. С другой стороны, при pH < 3 карбоксильные группы сорбента полностью переходят в протонированную форму и становятся неспособными к сорбции. К тому же столь кислая среда может приводить к денатурации большинства белков, что неблагоприятно для выделения белков в нативной форме. Поэтому на слабых катионообменниках приходится формировать градиент от значений рН не ниже 2.5-3. Это несущественное ограничение, так как мало биологических биполярных веществ, имеющих pI < 2.5. Конечное значение градиента pH определяется максимальными значениеми pI разделяемых веществ и обычно не превышает 7-8. Для лучшего выявления характерных участков градиентов использовали сорбент MacroPrep 50 CM, проявляющий буферирующую способность в требуемом интервале pH.
Выбор подвижных фаз. При формировании восходящих градиентов так же, как и для нисходящих, используют полибуферные элюенты. В качестве стартовых растворов применяли слабые органические кислоты (из-за низкого значения рН начальной области градиента), реже - те же полибуферы при более низком pH за счет добавления HCl [2, 3]. Мы выбрали в качестве компонентов для стартовых растворов уксусную, щавелевую, винную, лимонную кислоты, обладающие буферной емкостью в кислой области. Исходя из систем, подобранных для формирования нисходящих градиентов [14], элюенты простого состава (не более двух компонентов) готовили из слабого основания (например, Трис) и карбоновой кислоты. Трис фКа = 8.1) широко применяют для многих задач в хроматофокусировании в качестве компонента для стартовых растворов [1, 2] и иногда - в составе элюента [10].
Градиент, полученный при использовании "По-либуфера-96", плавный и достаточно линейный в области pH 4-7 (рис. 1, кривая 1), что оптимально для задач хроматофокусирования. Природа слабой кислоты в составе стартового раствора практически не сказывается на профиле градиента, за исключением начального участка (при pH < 4): наиболее резкое увеличение pH наблюдали в случае уксусной и щавелевой кислот. ^иболее плавным этот участок становится в случае использования лимонной или винной кислот, а при pH > 4 профиль градиента остается неизменным. Таким образом, данный эксперимент подтвердил то, что было известно для нисходящих градиентов pH, формируемых на слабых катионообменниках [13]. Варьирование концентрации лимонной или винной кислоты (1-6 мМ) не привело к изменению формы участка. Поэтому в дальнейшем использовали стартовые растворы на основе 2 мМ лимонной кислоты.
Влияние природы и концентрации элюента.
Элюент на основе только одного буферного компонента (Трис) не позволяет сформировать градиент приемлемой формы (рис. 1, кривая 2): в области рН 3-4 наблюдается очень медленное повышение рН, затем, напротив, в течение нескольких минут рН повышается на 3.5 ед. Подобную форму градиента можно объяснить тем, что на начальном участке сказываются буферные свойства лимонной кислоты, а Трис при рН < 7 практически не обладает буферной емкостью. Другой недостаток градиента - слишком продолжительное время выхода (до 2 ч). Для улучшения формы градиента следует добавить в элюент слабую кислоту, имеющую рКа = 4-7. Мы выбрали лимонную кислоту (рКа 3.10; 4.76; 6.40), к тому же то, что она входит в состав стартового раствора, незначительно усложнит систему в целом. Градиент, полученный при содержании в элюенте 1 мМ лимонной кислоты, можно назвать квази-линей-ным [10, 11]: он состоит из двух практически линейных
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.