ш
УДК 577.152.34
ПРОТЕАСОМЫ ПРИ АЛЛОТРАНСПЛАНТАЦИИ ТКАНИ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В УСЛОВИЯХ ИНДУКЦИИ ДОНОРСПЕЦИФИЧЕСКОЙ
ТОЛЕРАНТНОСТИ У КРЫС
© 2014 г. А. А. Степанова*, #, Я. Д. Карпова*, Г. А. Божок**, В. Д. Устиченко**, Ю. В. Люпина*, Е. И. Легач**, М. С. Вагида***, Д. Б. Казанский***, Т. П. Бондаренко**, Н. П. Шарова*
*ФГБУНИнститут биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334, Москва, ул. Вавилова, 26 **Институт проблем криобиологии и криомедицины НАНУкраины, 61015, Харьков, ул. Переяславская, 23 ***ФГБУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, 115478, Москва, Каширское шоссе, 23
Поступила в редакцию 29.04.2013 г. Принята к печати 17.06.2013 г.
Исследован пул протеасом печени крыс Август (ЯТ1С) через 30 дней после аллотрансплантации ткани щитовидной железы крыс Вистар (ЯТ1и) под капсулу почки с предшествующей индукцией до-норспецифической толерантности интрапортальным введением спленоцитов донора или без таковой. Определен уровень общего пула протеасом, иммунных протеасом, содержащих субъединицы ЬМР2 и/или ЬМР7, а также 19S- и 118-регуляторов протеасом. В качестве контрольных групп использовали интактных и ложнооперированных крыс. Показано увеличение уровня иммунных протеасом всех типов и 118-регулятора и уменьшение уровня общего пула протеасом и 19S-регулятора в печени экспериментальных животных по сравнению с контрольными группами, что указывает на изменение функционального состояния печени после трансплантации. В печени крыс без индукции толерантности происходит увеличение соотношения регуляторов 19S/11S по сравнению с толерантными животными. В печени толерантных крыс с прижившимися трансплантатами значительно возрастает количество мононуклеарных клеток, экспрессирующих иммунную субъединицу ЬМР2, по сравнению с животными без индукции толерантности и контрольными животными. При исследовании ткани прижившихся трансплантатов обнаружено увеличение в ней соотношения иммунных субъединиц ЬМР2/ЬМР7 и регуляторов 198/118 по сравнению с тканью, замещающей отторгнутые трансплантаты. В контрольной интактной ткани щитовидной железы практически отсутствуют иммунные протеасомы, а соотношение 198/118 в ней максимально. Таким образом, развитие иммунной реакции или ее подавление сопровождается изменением баланса различных форм протеасом. Иммунная субъединица ЬМР7 и регулятор 118 связаны с запуском иммунного ответа против чужеродной ткани, а иммунная субъединица ЬМР2 и регулятор 198, очевидно, важны для развития иммунологической толерантности и функционирования прижившейся ткани. Иммунофлуоресцентное исследование трансплантатов выявило низкое содержание иммунных протеасом в тироцитах сохранившихся фолликулов. Это может быть показателем отсутствия иммунного ответа против клеток, продуцирующих гормоны, поскольку при низком содержании иммунных протеасом в цитоплазме затруднено образование антигенных эпитопов для молекул главного комплекса гистосовместимости класса I.
Ключевые слова: протеасомы, иммунные протеасомы, портальная толерантность, трансплантация щитовидной железы, печень, иммунологическая толерантность.
БОТ: 10.7868/80132342314010102
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время трансплантация тканей эндокринных желез — это способ восстановления утраченной функции продукции гормонов. Однако при пересадке аллогенных органов и тканей активируется иммунная система реципиента и за-
Сокращения: ДСТ — донорспецифическая толерантность, ГКГ — главный комплекс гистосовместимости, ГРЫу — интерферон гамма. # Автор для связи (тел.: +7(499) 135-88-47; факс: +7 (499) 135-80-12; эл. почта: stepannette@gmail.com).
пускается процесс острого отторжения трансплантата. Как было показано ранее, применение препаратов, подавляющих иммунный ответ реципиента, может нежелательным образом сказываться на гормонпродуцирующей функции эндокринных желез [1, 2], поэтому представляется перспективной возможность индукции специфической толерантности к трансплантату.
При введении донорских клеток в воротную вену печени реципиента за 7—14 дней до трансплантации можно вызвать донорспецифическую толе-
рантность (ДСТ) к трансплантату. До настоящего времени механизм подобной толерантности изучен плохо; считается, что важную роль при этом играет система регуляции иммунного ответа в печени, где баланс между иммунной реакцией и иммунологической толерантностью сдвинут в сторону последней. Эффект ДСТ изучают на клеточном уровне в экспериментальных моделях, а также в клинике при аллотрансплантации почки, сердца, печени, кишечника, кожи, фрагментов периферического нерва [3—8], однако молекулярные механизмы данного феномена до сих пор до конца не исследованы. Ранее нами впервые было показано продление жизни трансплантатов эндокринных желез при индукции ДСТ интрапортальным введением спленоцитов [9—11]. Морфометрический анализ аллотрансплантатов щитовидной железы и анализ гормонпродуцирующей функции показали, что индукция толерантности приводит к снижению частоты случаев острого отторжения трансплантатов, позволяет отсрочить хроническое отторжение трансплантата и повышает сохранность ткани щитовидной железы на 47% через 30 дней после трансплантации [11].
Не исключено, что на молекулярном уровне важную роль в развитии портальной толерантности играют мультифункциональные ферментативные системы, к числу которых относятся про-теасомы. Одним из факторов, подтверждающих эту гипотезу, является успешное применение ингибитора активности протеасом бортезомиба в трансплантологии в качестве иммуносупрессанта [12—14]. Протеасомы представляют собой крупные белковые комплексы, осуществляющие избирательную деградацию клеточных белков [15, 16]. Множественные формы протеасом в клетках млекопитающих различаются протеолитически активными субъединицами и присоединенными регуляторами. 198-Регулятор выполняет функции распознавания и связывания убиквитинированных белков, их расплетания и проталкивания в протео-литическую камеру. 118-Регулятор служит адаптером протеасом. Кроме того, в его присутствии увеличивается образование антигенных эпитопов из некоторых белков для молекул главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) I класса.
К особой группе протеасом относятся иммунные протеасомы, содержащие протеолитически активные субъединицы ЬМР7 ф51), ЬМР2 (в И) и ЬМР10 (МЕСЫ, Р21) вместо протеолитических субъединиц Хф5), Y(P1) и Z(P2) конститутивных протеасом и участвующие в образовании антигенных детерминант для презентации в составе молекул ГКГ I класса [17]. Таким образом, иммунные протеасомы необходимы для развития полноценного Т-клеточного иммунного ответа. Участие иммунных протеасом в функционировании Т-лимфоцитов не ограничивается образованием ими антигенных эпитопов. Иммунные про-
теасомы важны для выживания, пролиферации и активации лимфоцитов при иммунном ответе [18]. В случае дефицита иммунной субъединицы ЬМР2 невозможна эффективная активация транскрипционного фактора МБкВ [19, 20]. Известна также специфическая функция иммунных проте-асом, не связанная с их иммунными свойствами, а именно их участие в подавлении окислительного стресса [19]. Вместе с тем, отсутствуют сведения об участии протеасом, в том числе иммунных протеасом, в развитии специфической иммунологической толерантности.
На клеточном уровне основные процессы развития ДСТ локализуются в печени. Несмотря на то, что печень не является вторичным лимфоид-ным органом, в ней происходят процессы активации лимфоцитов [21]. Однако активированные в печени лимфоциты приобретают не эффектор-ный провоспалительный фенотип, а наоборот, становятся регуляторными толерогенными клетками. В целом, можно выделить несколько особенностей иммунитета печени, важных для поддержания его особого статуса преобладания иммунологической толерантности над иммунным ответом [22, 23]. Во-первых, это специфика профессиональных и непрофессиональных антигенпрезентирующих клеток печени [21, 24—26], во-вторых, особый цито-киновый профиль микроокружения [27], в-третьих, высокоэффективная неспецифическая иммунная защита, позволяющая запускать специфический ответ лишь в "крайних" случаях, в-четвертых, деле-ция активированных провоспалительных Т-лим-фоцитов [22]. Считается, что эти механизмы поддерживают состояние иммунологической толерантности к аллогенным трансплантатам.
В данной работе мы поставили цель выяснить, какие изменения происходят на уровне экспрессии и локализации различных форм протеасом в печени крыс с аллогенной трансплантацией ткани щитовидной железы, а также в самом трансплантате при индукции ДСТ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование проводили на печени крыс-реципиентов через 30 дней после трансплантации ткани щитовидной железы. Экспериментальные животные были разделены на две группы. Первой группе за 7 дней до трансплантации вводили спленоциты донора в воротную вену, животные второй группы этой процедуре не подвергались. Контрольные группы составляли интактные и ложнооперированные животные. Данная модель эксперимента позволяет выявить механизмы индукции толерантности, локализованные в печени. Для выявления механизмов толерантности, поддерживаемой в самом сайте антигенной локализации — чужеродных трансплантатах, исследовались функционирующие трансплантаты с сохраненной струк-
в-Актин (43 кДа)
а1,2,3,5,6,7 (29-32 кДа)
Л Л
.О ,и ^
/ * V
(a)
и — ЬМР7 (26 кДа) ЬМР2 (23 кДа) - - ■
— — - ■
12
д.
о
л. о 10
,7, 8
,6,
,5,
3, 6
,2,
1,
а 4
о
и
н
а 2
*
р
о
д 0
о
С
(б)
^ 180
ч
о
7
Рч
и 2
Рч
150 -
120 -
90 -
ДСТ
о
и н
а
*
р
о д
о
60 -
30 -
+ДСТ Контроль ^
ДСТ
+ДСТ Контроль
0
Рис. 1. Экспрессия субъединиц а1,2,3,5,6,7 и иммунных субъединиц ЬМР2 и ЬМР7 протеасом в печени крыс после трансплантации ткани щитовидной железы. (я) Вестерн-блоты белков осветленных гомогенатов печени крыс с использованием антител к субъединицам а1,2,3,5,6,7 и иммунным субъединицам ЬМР2 и ЬМР7. (б) Относительные величины интегрального поглощения белковых полос, нормированные на уровень Р-актина, за 10 принята величина в контрольной группе животных. "—ДСТ" и — "+ДСТ" — группа без индукции
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.