т
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 10, с. 761 - 766
УДК 577.152:543.51
ПРОТЕИНАЗА ЕСР 32: ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТА, ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ
© 1995 г. Г. А. Казакина, Е. П. Миргородская, О. А. Миргородская, С. Ю. Хайтлина
Институт цитологии РАН, 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий просп., 4
Поступила в редакцию 14,12.94 г.
С использованием офВЭЖХ и масс-спектрометрии с электрогидродинамическим способом ионизации исследовано действие актиндеградирующей протеиназы ЕСР 32 Е. coli на С-пептид из рекомби-нантного проинсулина человека, инсулин свиньи и мелиттин. Показано, что протеиназа гидролизу-ет только мелиттин с расщеплением связей Ala15-Leu16 или LeuI6-Ile17.{Кт 2.4 х 1С)"6 М). Изучено влияние pH и состава буфера на скорость ферментативной реакции. pH-Оптимум гидролиза мелит-тина ~7. Отмечено ингибирующее действие фосфат-ионов и активирующее действие АТР на ферментативный гидролиз мелиттина. Предложено использовать мелиттин для определения активности протеиназы ЕСР 32.
Ключевые слова: протеиназа Е. coli актиндеграбирующая, АТР-стимулируемая протеиназа, мелиттин, масс-спектрометрия.
В работе [1] показано, что бактериальный штамм Е. соИ А2 продуцирует протеин азу ЕСР 32, обладающую способностью к ограниченному протеолизу нативного актина по пептидной связи 01у42-Уа143, локализованной в той части молекулы белка, которая непосредственно вовлечена в контакт между мономерами в полимере актина и участвует во взаимодействии с ДНКазой 1 [2]. Расщепленный протеиназой ЕСР 32 актин, сохраняя нативную структуру [1], качественно изменяет функциональные свойства [3, 4], что делает модифицированный белок уникальной моделью для изучения механизмов полимеризации актина и его взаимодействия с актинсвязывающими белками.
Значимость новой протеиназы для структурных исследований актина стимулировала работы по изучению ее субстратной специфичности [5, 6]. В качестве субстратов был испытан ряд произвольно взятых белков (более 20), включая инак-тивированную и денатурированную формы актина. Было показано, что в инактивированном актине (нагрев или обработка ЕОТА) кроме связи 01у42-Уа143 гидролизуются также связи А1а29-Уа130 и йег33—Не34. Для денатурированной формы актина были обнаружены дополнительные разрывы пептидных связей, образованных карбоксильными группами основных аминокислот. Помимо актина протеиназа ЕСР 32 гидролизует гистоны и гистоноподобный белок бактерий Ни [5, 6]. Хотя типы разрываемых связей для гистонов и гисто-
Сокращения: TFA - трифторуксусная кислота; офВЭЖХ -обращенно-фазовая ВЭЖХ; Qn - Са-амид глутамина.
ноподобного белка не были определены, можно полагать, что их гидролиз протеиназой обусловлен повышенным содержанием основных аминокислот.
Выявленная способность к гидролизу различных типов пептидных связей делает актуальным продолжение исследований, направленных на определение специфичности ЕСР 32 протеиназы с использованием модельных субстратов с известной аминокислотной последовательностью. В настоящей работе для этих целей были использованы рекомбинантный С-пептид из проинсулина человека, инсулин свиньи и мелиттин, в которых представлены все возможные типы аминокислот -кислые, основные и алифатические.
Одной из задач работы был также поиск пептидного субстрата, пригодного для тестирования активности протеиназы ЕСР 32 и изучения ее каталитических свойств. Сопоставление свойств фермента в отношении этого субсграта и актина позволило бы разграничить влияние различных факторов как на собственно фермент, так и на актин. Отметим, что нативный актин - сложно организованный белок, свойства которого, включая способность к полимеризации и денатурации, несомненно, зависят от характеристик среды [7].
Для тестирования продуктов гидролиза нами использованы офВЭЖХ и масс-спектрометрия с электрогидродинамическим способом ионизации (ESI MS), эффективное сочетание которых продемонстрировано в работах [8, 9]. Это позволило с помощью масс-спектрометрического анализа как суммарного гидролизата, так и отдельных
^210
(а)
¿280 (б)
0.Î
0.4
0.4
0.2
10
15
мин
Рис. 1. ВЭЖХ-анализ продуктов 2-часового гидролиза мелиттина протеиназой ЕСР 32. Условия гидролиза: 0.1 М трис-НС1-буфер, рН 7.4; [мелиттинИЕ]] (и'/н-)= 100: 1.
хроматографических пиков идентифицировать образующиеся пептиды. Кроме того, по площадям хроматографических пиков с учетом коэффициентов оптического поглощения для идентифицированных пептидов, рассчитанных по аддитивной схеме [10], были оценены концентрации исходного субстрата и продуктов его гидролиза, что позволило количественно оценить скорости протеолиза.
Эксперименты были начаты с изучения действия протеиназы ЕСР 32 на мелиттин
кУк-
1*2
10
20
26
GIG A VLK VLTTGLPALIS WIKRKRQQn
Как видно из рис. 1 и табл. 1, исследуемая про-теиназа эффективно гидролизует мелиттин, рас-
щепляя его за 2 ч на четыре фрагмента (1 - 4), два из которых являются триптофансодержащими (пик 5 соответствует исходному мелиттину). Таким образом, при рН 7.4 фермент гидролизует в мелит-тине только две пептидные связи, образованные алифатическими аминокислотными остатками ; либо AlaI5-Leu16 (&,), либо Leu!6-Ile17 (к2). При этом не гидролизуются связи, образованные другими алифатическими аминокислотами. Скорость гидролиза связи AIa15-Leu16 приблизительно в 4 раза превышает таковую для Leu'Mle'7, т.е. отношение "индексов специфичности" {kjК*т)1(к21 К"т) близко к 4. Идентичные разрывы наблюдаются при снижении рН реакционной среды до 4.5, однако указанное отношение в этих условиях приближается к 1. Можно отметить, что степень очистки проте-иназы ЕСР 32 (препараты Е, или Е2, см. "Экспер. часть") не влияет на характер гидролиза мелиттина. Увеличение времени инкубации обоих препаратов фермента с мелиттином до 22 - 24 ч ведет к образованию новых пептидных фрагментов (рис. 2а, 26, табл. 2), появление которых вызвано гидролизом связей, образованных карбоксильными группами основных аминокислот: Lys7, Arg22, Arg24. Установлено, что при хранении разбавленных растворов препаратов фермента (0.01 мг белка/мл, 0.02 M трис-НС1-буфер, рН 7.4, 8°С) они по крайней мере в течение 2 нед полностью сохраняют свою актиндеградирующую активность и скорость гидролиза по алифатически аминокислотным остаткам в мелиттине, что указывает на их высокую стабильность. В то же время они в значительной мере теряют способность к последующему гидролизу связей, образованных основными аминокислотами (рис. 26, табл. 3). Это дает основание предположить, что проявление подобной специфичности скорее всего следует отнести к присутствию в ферментных препаратах примесной протеиназы. Поскольку при выделении фермента для тестирования активности использовался нативный актин, присутствие другой протеиназы
Таблица 1. Масс-спектрометрический анализ хроматографических плков гидролизата мелиттина (рис. 1)
Номер пика Масс-спектрометрические данные M, Да Продукт (положение в цепи)
m/z /, % z экспер. расчет.
1 448.2 100 +3 1341.4 1341.6 (17-26)
671.6 30 +2
2 485.8 100 +3 1454.5 1454.8 (16-26)
728.3 10 ■ +2
3 705.9 100 +2 1409.8 1409.7 а -15)
1410.8 11 + 1
4 762.4 100 ~ +2 1522.8 1522.9 (1 -16)
5 712.9 100 +4 2847.7 2846.5 (1 - 26)
949.9 21 +3
Рис. 2. ВЭЖХ-анализ продуктов 24-часового гидролиза мелиттииа препаратами протеиназы ЕСР 32: Е] (а) и Е2, предварительно инкубированным 2 нед при 8°С (б). Условия гидролиза см. в подписи к рис. 1.
не проявлялось, однако можно полагать, что именно действием примесной протеиназы обусловлено появление дополнительных разрывов при протеолизе денатурированного актина.
Таким образом, полученные результаты позволяют считать, что гидролиз мелиттина протеи-назой ЕСР 32 (так же, как было ранее показано для актина [1]) носит характер ограниченного протеолиза.
В то же время протеолиз мелиттина, по-видимому, не определяется структурными особенностями строения пептида, поскольку идентичные разрывы наблюдались при гидролизе про-теиназой ЕСР 32 его триптического фрагмента УЬТТОЬРАЬ13\\ТК (данные не приводятся).
Оценка действия протеиназы ЕСР 32 на два других пептидных субстрата показала, что в от-
личие от мелиттина ни С-пептид, ни инсулин (при тех же условиях и при более длительном времени инкубации) не гидролизуются ферментом (данные не приводятся).
Необходимо отметить, что оба негидроли-зуемых субстрата содержат пептидные связи (Ala-Val), аналогичные связям, расщепляемым протеиназой ЕСР 32 в мелиттине. Наличие не расщепляемых этим ферментом Ala-Val-связей отмечается и в других испытанных ранее в качестве субстратов нативных и денатурированных белках [5, 6]. Возможно, что этот факт связан с вторичной специфичностью изучаемого фермента. Однако для понимания причин, обусловливающих выявленную специфичность и ограниченный характер протеолиза в отношении актина и мелиттина, нужны дополнительные исследования, включающие поиск новых субстратов, в том числе
Таблица 2. Масс-спектрометрический анализ гидролизата мелиттина (рис. 2а)
Масс-спектрометрические данные
номер иона
m/z
/, %
М, Да
экспер.
расчет.
Продукт (положение в цепи)
1
2
3
4
5
6
7
8 9
10 11 12
336.7 .
401.8 458.3
486.1 488.0 544.5 657.5
705.7 716.6* 725.1**
762.2
771.8
2
4 3
100 15 11 8
97
5 2
23
3
+2 +2 +2 +3 +2 +2 + 1 +2 +2 +2 +2 + 1
671.4 801.6 915.6
1455.3 974.0
1087.0
656.5
1409.4
1432.3 1448.2
1522.4 770.8
671.9 802.0
915.1
1454.8
973.2 1086.4
656.8 1409.7 1409.7 1409.7
1522.9
770.9
-16)
7-22) 6-22) 6-26)
8-24) 7-24)
-7)
-15)
-15)
-15)
-16)
-15)
* Квазимолекулярный ион ** Квазимолекулярный ион
[М + Н + Na]2+. [М + Н + К]2+.
[ЫаС1], мМ (5) " vorl¡,% 20 40 60 80 100
рН (1-4)
Рис. 3. Зависимость скорости гидролиза мелиттина протеиназой ЕСР 32 от рН (/ - 4) и от величины ионной силы (5). Буферные растворы: 0.1 М трис-малеат-ный (/); 0.1 М натрий-ацетатный (2); 0.1 М натрий-фосфатный (3); 0.1 М трис-НСГ (4); 0.01 М трис-НС1, рН 7.4 (5). vmн=v/Vx 100%.
"физиологических", а также изучение структуры самого фермента.
С использованием мелиттина в качестве субстрата были исследованы нек
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.