УДК 577.112.083.3
ПРОТЕКТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ ФРАГМЕНТОВ ПРИОННОГО БЕЛКА ПРИ ИММУНИЗАЦИИ ЖИВОТНЫХ С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО ИНДУЦИРОВАННОЙ ФОРМОЙ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА
© 2015 г. О. М. Вольпина*, Т. Д. Волкова*, #, Н. И. Медвинская**, А. В. Камынина*, Я. В. Запорожская*, И. Ю. Александрова**, Д. О. Короев*, А. Н. Самохин**, И. В. Нестерова**, В. И. Дейгин*, Н. В. Бобкова**
*ФГБУНИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 ** ФГБУНИнститут биофизики клетки РАН, 142290, Пущино, ул. Институтская, д. 3 Поступила в редакцию 05.08.2014 г. Принята к печати 13.08.2014 г.
Прионный белок является одной из мембранных мишеней бета-амилоида, основного нейротокси-ческого агента при болезни Альцгеймера. Нами был осуществлен выбор и синтез фрагментов при-онного белка 17—33, 23—33, 95—110 и 101 — 115, ответственных за связывание с бета-амилоидом. Было изучено влияние иммунизации пептидами на развитие признаков болезни у животных с экспериментально индуцированной формой болезни Альцгеймера. Показано, что иммунизация свободным пептидом 17—33 и белковыми конъюгатами пептидов 23—33 и 101—115 приводит к восстановлению состояния пространственной памяти животных. Также показано, что иммунизация пептидом 17—33 приводит к снижению уровня мозгового бета-амилоида и восстановлению морфо-функциональных показателей мозга.
Ключевые слова: болезнь Альцгеймера, прионный белок, бета-амилоид, синтетические пептиды.
DOI: 10.7868/S0132342315020165
ВВЕДЕНИЕ
Прионный белок (PrPc) — мембранный глико-протеин, наиболее высокая концентрация которого выявлена на поверхности нейронов, хотя его могут синтезировать и многие другие клетки организма. Резкое изменение конформации прион-ного белка, приводящее к формированию бета-складчатой структуры и отложениям депозитов нерастворимой формы белка (PrPSc), служит причиной группы заболеваний различной этиологии, называемых прионными болезнями [1]. Также известно о его связи с болезнью Альцгеймера, причем различные исследования свидетельствуют как о патогенной, так и о протективной роли PrPc в развитии болезни. Было показано, что при патологии агрегаты прионного белка часто соседствуют с бляшками бета-амилоида — 40-42-членного пептида, растворимые олигомеры и нераствори-
Сокращения: БЭ — бульбэктомированные; ЛО — ложноопе-рированные; НАФ — неполный адъювант Фрейнда; ПАФ — полный адъювант Фрейнда; Fmoc — 9-флуоренилметокси-карбонил; KLH — гемоцианин улитки; OVA — овальбумин; PBS — фосфатно-солевой буфер. # Автор для связи (тел.: +7 (495) 336-57-77; эл. почта: tdvol@mx.ibch.ru).
мые агрегаты которого считают основным нейро-токсическим агентом болезни Альцгеймера [2—4]. С другой стороны, установлена способность PrPc ингибировать гамма-секретазу BACE1, расщепляющую белок-предшественник бета-амилоида АРР, и тем самым препятствовать продукции бета-амилоидных пептидов [5]. Предполагают, что протективная способность присуща только одному генетически определенному варианту белка, а полиморфизм нуклеотидной последовательности ДНК, приводящий к замене аминокислотного остатка Met на остаток Val в 129 положении белка PrPc, является фактором риска в развитии болезни Альцгеймера [6, 7]. Причина патогенной роли PrPc до недавнего времени оставалась невыясненной. Установлено, что нормальный прионный белок является одной из мембранных мишеней бета-амилоида [8]. В опытах in vitro показано высокоаффинное связывание синтетических растворимых олигомеров бета-амилоида с участком 95—110 мембранного PrPc. Введение моноклональных антител, направленных к этому участку PrPc, приводит к восстановлению когнитивных показателей у трансгенных мышей с признаками болезни Альц-геймера, по-видимому, в результате предотвраще-
Таблица 1. Синтетические фрагменты прионного белка PrPc
Пептид Фрагмент Аминокислотная последовательность
(I) 17-33 SDLGLCKKRPKPGGWNT*
(II) 23-33 KKRPKPGGWNT
(III) 95-110 THSQWNKPSKPKTNMK
(IV) 101-115 KPSKPKTNMKHMAGA
* Подчеркнут потенциальный Т-хелперный эпитоп.
ния связывания агрегированной формы бета-амилоида с прионом [9, 10]. Ранее нами был показан протективный эффект как от активной иммунизации мышей c экспериментально индуцированной формой болезни Альцгеймера пептидом 95— 123, так и от пассивного введения специфичных к нему антител [11]. Протективные свойства проти-вопептидных антител подтверждены также in vitro в модели болезни Альцгеймера на культурах клеток [12].
Необходимо подчеркнуть, что этот же участок отвечает за превращение нормального белка PrPc в его патогенную изоформу PrPSc [13—15]. В то же время, установлено, что участок 95—123 прионно-го белка не является единственным сайтом связывания с бета-амилоидом. В опытах in vitro с использованием рекомбинантного приона с деле-циями различных участков и перекрывающихся синтетических фрагментов было показано, что в связывании с олигомерами бета-амилоида участвует также ^-концевой фрагмент 23—27 или 23— 39 [16, 17].
Целью настоящей работы явилось изучение терапевтического эффекта иммунизации животных с экспериментально индуцированной формой болезни Альцгеймера синтетическими пептидами, соответствующими фрагментам ^-концевой части прионного белка, при этом оценивали состояние пространственной памяти, биохимические показатели и морфофункциональное состояние мозга. Также для локализации участка, ответственного за протективную активность известного пептида 95—123, были изучены свойства его двух укороченных перекрывающихся фрагментов.
Таблица 2. Характеристики синтетических пептидов
Пептид Время удерживания*, мин М теор. М+Н
(I) 15.42 1857 1857
(II) 10.75 1268.5 1269
(III) 9.95 1913 1913
(IV) 9.47 1626 1627.6
* Для аналитической ВЭЖХ этих пептидов (эксперим. часть).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Фрагменты PrPc, выбранные в настоящей работе для синтеза и изучения, перечислены в табл. 1. Пептиды 17—33 (I) и 23—33 (II) соответствуют фрагментам ^-концевой неструктурированной части белка PrPc [18]. Они включают участок 23—27 и частично перекрывают участок 23—39, описанные в разных работах как сайт связывания с бета-амилоидом [16, 17]. Известно, что в результате посттрансляционных модификаций от молекулы предшественника прионного белка отщепляется фрагмент из первых 22-х а.о., поэтому нами был выбран для синтеза фрагмент, начинающийся с 23 а.о. 23—33 (II), и более протяженный пептид 17—33 (I). В пептиде (I) в положении 19 находится гидрофобный остаток Leu, а в положении 27 положительно заряженный остаток Lys, которые формируют потенциальный Т-хелперный эпи-топ, необходимый для индукции антител при иммунизации свободным пептидом [19]. Для локализации участка, ответственного за протективную активность описанного ранее пептида 95—123 [11], были получены два перекрывающихся фрагмента этого пептида: 95—110 (III) и 101—115 (IV).
Пептиды были синтезированы твердофазным методом с использованием Fmoc-производных аминокислот. Степень гомогенности синтетических пептидов была подтверждена данными аминокислотного анализа, масс-спектрометрии, ВЭЖХ и составляла более 95% (табл. 2).
Влияние иммунизации синтетическими пептидами на состояние пространственной памяти изучали на мышах линии NMRI, которым удаляли обонятельные луковицы (бульбэктомирован-ные мыши), в результате чего у мышей развивались поведенческие, биохимические и морфологические изменения альцгеймеровского типа. Данная модель, согласно литературным данным, является валидной моделью спорадической формы болезни Альцгеймера [20—22]. Для индукции антител мышей дважды иммунизировали пептидом (I) или конъюгатами пептидов (II), (III) и (IV) с гемоцианином улитки (KLH). Пептид (I) использовали в свободном виде, так как он содержит теоретически рассчитанный Т-хелперный эпитоп, необходимый для индукции антител, а пептиды (II), (III) и (IV), не содержащие потенци-
альных Т-эпитопов, для придания им иммуно-генности конъюгировали с высокомолекулярным носителем. Первую иммунизацию проводили до операции бульбэктомии, а вторую — после нее. Через 10 дней после второй иммунизации у мышей отбирали кровь для определения титров про-тивопептидных антител, а затем проводили обучение животных в водном лабиринте Морриса и тестировали состояние их пространственной памяти. Все пептиды были способны стимулировать образование антител (табл. 3). Титры проти-вопептидных антител измеряли индивидуально у каждого животного, в таблице для каждого имму-ногена приведен диапазон значений титров. Наиболее высокие титры наблюдали в сыворотках мышей, иммунизированных пептидами (I) и (II), причем, пептид (I) был высокоиммуногенен в свободном виде, а пептид (II) стимулировал образование антител в виде конъюгата с KLH. У животных, иммунизированных KLH-конъюгатами пептидов (III) и (IV), титры противопептидных антител были существенно ниже, наиболее низкий уровень антител индуцировал конъюгат пептида (III).
Пространственную память оценивали по достоверному превышению времени нахождения и числа заходов мышей в сектор обучения над остальными индифферентными секторами водного лабиринта Морриса. В качестве контроля использовали неиммунизированных ложноопе-рированных (ЛО) и бульбэктомированных (БЭ) животных. Все контрольные БЭ мыши характеризовались потерей пространственной памяти (ни одно животное не выделяло сектор обучения), в то же время все контрольные ЛО мыши демонстрировали высокий уровень пространственной памяти и достоверно выделяли отсек обучения (рис. 1, 2).
БЭ животные, иммунизированные пептидом (I) или конъюгатами пептидов (II) и (IV), были способны выделять сектор обучения путем более длительного нахождения в нем (рис. 1а, 2а). Эти же животные не выделяли контрольный сектор по числу заходов в него (рис. 1б, 2б). Данный факт свидетельствует о том, что предпочтительной моделью поведения обученных мышей является целевой заход в сектор обучения. Таким образом, получены достоверные результаты, демонстрирующие сохранение пространственной памяти у БЭ мышей в результате иммунизации пептидами (I),
(II) и (IV). Иммунизация конъюгатом пептида
(III) не индуцировала защитного эффекта.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.