ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 43, № 6, с. 720-729
УДК 581.132:577.175
ПРОТЕКТОРНОЕ ВЛИЯНИЕ ЦИТОКИНИНОВЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИЙ АППАРАТ РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ
ПРИ ВОДНОМ ДЕФИЦИТЕ
© 2007 г. О. Ф. Монахова*, И. И. Чернядьев**
*Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва, 127276
e-mail: ifr@ippras.ru **Институт биохимии им. А Н. Баха РАН, Москва, 119071 Поступила в редакцию 30.05.2006 г.
В условиях нарастающего дефицита воды у молодых проростков и листьев взрослых растений двух сортов пшеницы Triticum aestivum L. Мироновская 808 (более устойчивый) и Лютесценс 758 (менее устойчивый к водному стрессу) сравнивали защитное влияние на фотосинтетический аппарат цито-кинина 6-бензиламинопурина и обладающих цитокининовой активностью тидиазурона и картоли-на. На этапе засухи и последующей регидратации препараты картолина оказывали наиболее существенное защитное воздействие, способствуя меньшему снижению интенсивности фотосинтеза, карбоксилирующей активности ключевого фермента углеродного метаболизма - рибулозобисфос-фаткарбоксилазы/оксигеназы (КФ 4.1.1.39) и активности НАДФ-глицеральдегидфосфатдегидроге-назы - ферментного комплекса, включающего фосфоглицераткиназу (КФ 2.7.2.3) и глицеральде-гидфосфатдегидрогеназу (КФ 1.2.1.13). При этом возрастала величина удельной плотности листа и увеличивалась зерновая продуктивность растений. Негативное влияние водного стресса на фотосинтетический аппарат было сильнее выражено у менее устойчивого сорта Лютесценс 758 и у проростков по сравнению с листьями взрослых растений.
Продуктивность сельскохозяйственных растений во многом определяется их способностью противостоять стрессовым воздействиям окружающей среды. Одним из самых распространенных видов стресса у растений является водный дефицит, влияние которого затрагивает самые разные уровни: от экосистемы до гена. Хотя биохимические механизмы адаптации растений к водному стрессу изучены недостаточно, исследование стабильности и приспособительных возможностей более устойчивых генотипов и сортов представляет несомненный теоретический и практический интерес. Нарушения водного обмена при дефиците влаги существенным образом влияют на фотосинтетический аппарат [1-3]. Даже небольшое падение водного потенциала вызывает нарушение процесса фотосинтеза растений : закрытие устьиц и падение интенсивности транспирации, нехватку СО2 в фотосинтезирующих тканях и снижение интенсивности фотосинтетической ассимиляции углекислоты как интегрального показателя. Кроме того, по мере все большего снижения оводненности тканей происходят структурные и функциональные нарушения фотосинтетического аппарата, не связанные с устьичным фактором. По мнению некоторых авторов [4-6], увеличением устьичного сопротивления листа можно объяснить лишь менее 50% падения фотосинтеза. Такие результаты получены для листьев хлоп-
чатника (Gossypium hirsutum L.) [4], фасоли (Phaseolus vulgaris L.) [5], молодых сеянцев дуба (Quercus stellata Wangenh.), клена (Acer saccharum Marsch.) и черного ореха (Juglans nigrum L.) [6].
Степень неустьичного ингибирования фотосинтетической ассимиляции углекислоты при снижении водного потенциала листа определяется силой стресса и генотипической устойчивостью растений [3, 7]. При этом снижается пул фотосинтетических пигментов (хлорофиллов a, b, каротинов и ксантофиллов), ингибируется фотосистема II, нарушения работы которой выражены в большей степени и предшествуют ингибированию фотосистемы I, изменяется энергетический баланс из-за нехватки АТФ и восстановителя, снижается скорость регенерации рибулозо-1,5-бисфосфата, количество и активность ключевого фермента углеродного метаболизма - рибулозобисфосфат-карбоксилазы/оксигеназы (РБФК/О, КФ 4.1.1.39) [2, 3].
В литературе нет единого мнения о том, какие еще ферменты фотосинтетического метаболизма в большей мере теряют активность в условиях водного дефицита. По нашим данным [3], у пшеницы (Triticum aestivum L.), кроме РБФК/О, это НАДФ-глицеральдегидфосфатдегидрогена-за (ГАФДГ) - ферментный комплекс, включающий фосфоглицераткиназу (КФ 2.7.2.3) и глице-ральдегидфосфатдегидрогеназу (КФ 1.2.1.13).
Одним из перспективных способов повышения стабильности фотосинтетического аппарата растений при неблагоприятных воздействиях среды является обработка растений фиторегуляторами цитокининового типа. Цитокинины, как известно, играют важную роль в регуляции многих физиологических процессов растений, в частности фотосинтеза [3, 8].
В настоящей работе у проростков и взрослых растений пшеницы двух сортов - Мироновская 808 (более устойчивый) и Лютесценс 758 (менее устойчивый к засухе) - исследовали карбоксилиру-ющую активность РБФК/О, активность ГАФДГ, интенсивность фотосинтетической ассимиляции углекислоты, удельную плотность листа (УПЛ) -важный структурно-функциональный показатель состояния и активности фотосинтетического аппарата при стрессовых воздействиях [10] и зерновую продуктивность растений. В роли соединений с цитокининовой активностью использовали различающиеся по химической структуре 6-бензиламинопурин (БАП), тидиазурон (ТДЗ, К-фенил-№-1,2,3-тидиазолил-5-мочевина), карто-лин-2 (К-изопропоксикарбонил-о-4-хлорфенилкар-бамоил-этаноламин) и картолин-4 (о-изопропил-К-2-оксиэтилкарбамат). По величине цитокининовой активности препараты соответствовали ряду: картолины > ТДЗ > БАП [11-14].
Проведение таких исследований особенно актуально, поскольку до сих пор не выяснено, отличается ли механизм действия цитокининов с различной химической структурой [8, 9]. Расшифровка механизмов защитного влияния цитокининов на фотосинтетический аппарат позволит выработать стратегию максимального повышения устойчивости растений к действию стрессоров.
Цель работы - исследование защитного влияния отличающихся по химической структуре ци-токининовых препаратов на фотосинтетический аппарат и зерновую продуктивность пшеницы в условиях водного дефицита.
МЕТОДИКА
Объект исследования. Использовали растения пшеницы (ТгШсиш aestivum Ь.) двух сортов: Мироновская 808 (более устойчивый) и Лютесценс 758 (менее устойчивый к засухе).
Выращивание растений. Предварительно стерилизованные в 0.02%-ном растворе марганцовокислого калия в течение 30 мин и промытые в дистиллированной воде семена высевали в сосуды с 5 кг смеси, содержащей почву, песок и торф в соотношении 2 : 1 : 1 с добавлением основных элементов минерального питания из расчета 1.8 К, 1.6 Р и 1.2 К г действующего вещества/сосуд и выращивали в естественных условиях в вегетационном домике.
Для получения молодых проростков растения выращивали в течение 1 нед в водной среде в климатических камерах при температуре 22°С днем и 14°С ночью, при 14-часовом фотопериоде, освещая проростки дуговыми ртутными лампами ДРЛ-200 (освещенность 16 клк).
Обработка препаратами цитокининов. Обработку взрослых растений осуществляли через 1 месяц после посева семян в фазу кущения путем опрыскивания растворами цитокининовых фито-регуляторов (100 мг/л). Контрольные растения опрыскивали водой. Отбирали среднюю пробу из 10-15 листьев первого яруса, расположенных непосредственно под флаговым листом. В отдельных случаях использовали более молодые листья первого яруса с боковых побегов.
Семена, из которых получали проростки, предварительно помещали на 4 ч в растворы цитокининовых препаратов (100 мг/л) или в дистиллированную воду (контроль) и продували воздухом.
Создание водного дефицита. Через 2 нед после обработки цитокининовыми препаратами взрослые 1.5-месячные растения подвергали воздействию водного стресса путем полного прекращения полива и отбирали пробы через 1 и 2 нед. Затем полив возобновляли. Последующая регид-ратация продолжалась 1 нед. Проростки либо лишали воды на 1 сут и снова помещали в условия нормального водообеспечения (регидратация), отбирая пробы через 1 сут, либо (только для сорта Мироновская 808) имитировали водный дефицит за счет внесения в среду на 7 сут полиэтилен-гликоля-6000 в концентрации 1%.
Определение количества воды. Содержание воды в тканях и влажность почвы в сосудах измеряли весовым методом. Исходная наименьшая влагоемкость почвы равнялась 70%. По мере развития водного дефицита эта величина снижалась до 20%. Пробы растительного материала высушивали в термостате при 105°С до постоянного веса.
Приготовление ферментных препаратов. Бесклеточные препараты для определения активности ГАФДГ и РБКФ/О получали, как описано ранее [15], с использованием среды выделения, содержащей 0.05 М трис-НС1 буфер, рН 8.0, 0.4 М сахарозу, 0.01 М хлористый магний, 0.005 М ДТТ и нерастворимый поливинилпирролидон (2 г/л). Полученный гомогенат центрифугировали (20000 g, 30 мин). Все операции проводили при 2-4°С.
Активность ГАФДГ. Определения проводили спектрофотометрическим методом [15] с 3-фос-фоглицериновой кислотой по скорости убывания НАДФН и соответственно величины .340 в 2 см-кюветах при 30°С и pH 8.3 в термостатируемой ячейке на спектрофотометре Specord M-40 ("Carl Zeiss", Германия). Величину рН-оптимума определяли в предварительных опытах.
Активность РБФК/О. Карбоксилируюшую активность РБФК/О измеряли радиометрическим методом по стандартной методике [15] при температуре 30°С по скорости включения меченного по углероду 14С-бикарбоната натрия (А/О"Изотоп", Санкт-Петербург) с удельной активностью 15 мКи/ммоль в кислотоустойчивые продукты реакции. Величина рН-оптимума, определенная в предварительных опытах, составляла 8.0. Время предварительной инкубации реакционной смеси с 14С-бикарбонатом натрия было равно 3 мин. Реакцию проводили 2-4 мин, после чего фиксировали пробы 6 н HCl.
Включение радиоактивной метки. Скорость включения 14С в кислотоустойчивые продукты ферментативной реакции карбоксилирования ри-булозо-1,5-бисфосфата определяли путем жидкост-но-сцинтилляционной спектрометрии. Измерения проводили с помошью счетчика-спектрометра с биметаллическими фотокатодами SL 400 фирмы "Intertechnique" (Франция). В качестве растворителя использовали толуол марки "сцинтилляци-онный", а в качестве флуоресцируюших соедине-ний-2,5-дифенилоксазол (ДФО) с максимумом
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.