БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2015, том 41, № 3, с. 375-379
ПИСЬМА РЕДАКТОРУ
УДК 612.085.2:577.112.6
ПРОТЕКТОРНЫЕ ЭФФЕКТЫ МИЕЛОПЕПТИДОВ В КУЛЬТУРЕ
НЕЙРОБЛАСТОМЫ С-1300 © 2015 г. Т. М. Панкова*, А. М. Сапожников**, М. В. Старостина*, *
*ФБГУНаучно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики Сибирского отделения РАМН
630117, РФ, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2 **ФБГУНИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
РФ, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 11.11.2014 г. Принята к печати 04.12.2014 г.
Исследованы эффекты регуляторных пептидов костного мозга миелопептидов 1—6 в культуре ней-робластомы мыши С-1300. Показано, что миелопептиды стимулируют морфологическую диффе-ренцировку нейробластов. На моделях морфиновой токсичности и депривации кислорода и глюкозы в культуре выявлены нейропротекторные свойства миелопептидов.
Ключевые слова: миелопептиды, нейробластома, дифференцировка, нейропротекция.
БО1: 10.7868/80132342315030069
ВВЕДЕНИЕ
Циркулирующие иммунорегуляторные молекулы играют важную роль во взаимодействии иммунной и нервной систем [1]. Показано их участие в формировании синапсов в развивающемся и зрелом мозге, в регуляции синаптической активности и пластичности [2], в процессах обучения и запоминания [3], контроле эмоционального состояния и в развитии депрессии [4]. Выраженной нейротропной активностью обладает препарат "Миелопид", представляющий собой комплекс эндогенных иммуномодулирующих молекул, выделенных из культуры клеток костного мозга [5]. Изучая действие иммуномодулятора "Миелопид" на формирование экспериментальной зависимости от морфина, мы обнаружили, что его применение замедляет развитие хронической зависимости у животных, причем эффект был обусловлен входящими в состав препарата миелопептидами (МП) [6]. Их действие на развитие морфиновой зависимости могло быть следствием как нормализующего влияния на функциональную активность иммунной системы, так и прямого взаимодействия МП с клетками нервной ткани. В настоящее время идентифицированы и охарактеризованы шесть пептидов (МП1: Рке-Ьеи-01у-РИе-Рго-ТЬг, МП2: Ьеи-Уа1-Уа1-Туг-Рго-Тгр, МП3: Ьеи-Уа1-Су8-Туг-Рго-С1п, МП4: РИе-Аг§-Рго-Лг§-11е-Ме1-ТЬг-Рго, МП5: Уа1-Уа1-Туг-Рго-Лзр, МП6: Уа1-Лзр-Рго-Рго), определены их клетки-мишени,
#Автор для связи (тел.: +7 (383) 333-54-72; эл. почта: тагта@питЪЪ.ги).
выявлены особенности и механизмы иммуномо-дулирующего действия [7]. Однако взаимодействие МП с нервной системой практически не изучено. Очевидно, что использование МП для анализа нейротропных эффектов эндогенных им-муномодуляторов костномозгового происхождения имеет несомненный интерес. В представленной работе с целью оценки возможности прямого взаимодействия МП с клетками нервной ткани мы изучали влияние МП на клеточную линию ней-робластомы С-1300, которая широко используется для исследования дифференцирующих и нейро-протекторных свойств биологически активных соединений [8].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Культуры нейробластом человека и животных широко используются для изучения процессов дифференцировки, скрининга биологически активных соединений, поиска веществ, обладающих нейропротекторными свойствами [8]. Влияние МП на дифференцировку клеток было обнаружено ранее при работе с клетками костного мозга мышей, костного мозга и периферической крови больных с гемобластозами, клеточными линиями миеломонобластозного лейкоза человека НЬ-60 и эритробластного лейкоза К-562 [5, 9, 10], что открывало перспективы использования МП в комплексной терапии лейкозов. Противоопухолевая активность МП в отношении перевиваемых опухолей немиелоидного ряда (аденокарциномы молочной железы Са-755, саркомы S 180, мелано-
60
40
20
100
К МП1 МП2 МП3 МП4 МП5 МП6
Рис. 1. Влияние миелопептидов на морфологическую дифференцировку клеток нейробластомы С-1300. 48 ч культивирования с МП1—6 в концентрации 0.01 мкг/мл; К — контрольная культура; достоверность отличий: * -р < 0.05, ** -р < 0.01.
о
о о
Е ^ s „
S g
D и
О ñ
Я W
Й X
5 М о
В
О
80
60
40
20
К 0.1 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 Концентрация морфина, мМ
Рис. 2. Доля выживших клеток в культуре нейробластомы С-1300 в зависимости от концентрации морфина; К - контрольная культура.
**
**
*
0
0
мы В-16 и ряда других) зависит от нормализации функциональной активности иммунной системы, в первую очередь — Т-лимфоцитов [5, 9, 10], а не от прямого действия МП на клетки опухоли [11]. МП достоверно увеличивали количество морфологически дифференцированных нейронов в культуре нейробластомы С-1300 (рис. 1). Полученные нами результаты позволяют предполагать, что МП могут оказаться эффективны и в лечении нейробластом не только благодаря иммунокоррекции, но и за счет способности индуцировать дифференциров-ку нейробластов.
Клетки культур нейробластомы человека и животных содержат опиатные рецепторы различных типов, что позволяет использовать их для изучения эффектов морфина и других опиатов [12, 13]. Ней-робластома С-1300 реагировала на добавление морфина к культуральной среде, причем низкие его концентрации 10—100 мкМ не влияли на жизнеспособность культуры и способствовали нейритогене-зу (относительное количество дифференцированных клеток составляло в контроле 27.70 ± 2.6%, при концентрации морфина 10 мкМ — 53.14 ± 4.3%, и при концентрации 100 мкМ — 58.63 ± 6.91%, р < < 0.01), в то время как высокие 0.5—4 мМ вызывали гибель клеток. Кривая зависимости токсичности морфина от концентрации, представленная на рис. 2, практически идентична полученной на нейробластоме линии SH-SY5Y [12]. В той же работе авторы отмечали, что токсические эффекты морфина не опосредованы его взаимодействием с ц-опиатным рецептором, так как не блокируются добавлением налоксона. По нашим данным, на-локсон в концентрации 100 мкМ не влиял на токсичность морфина: количество живых клеток составляло 94.97 ± 0.9% в контроле, 27.83 ± 2.3% при добавлении 2 мМ морфина и 26.08 ± 2.11%
при одновременном внесении морфина и налоксона. Вероятно, токсическое действие морфина на клетки нейробластомы опосредуется другими типами опиатных рецепторов.
В экспериментах по изучению протекторных свойств МП использовали концентрацию морфина 2 мМ. Выбор эффективной концентрации МП проводили в экспериментах с МП1 и МП2. Как можно увидеть на рис. 3, МП достоверно увеличивают долю выживших клеток нейробластомы, подвергнутых действию 2 мМ морфина, при этом МП2 эффективен в концентрации 0.01 мкг/мл, а МП1 — и в более низких концентрациях. Изучение эффектов МП3—МП6 на модели морфиновой ток-
100
о
о
е
Е ^ и
е е
§ 3
л X
О *
о
тн От
80
60
40
20
M
i
0.01 0.005 0.001 0.01 0.005 0.001 мкг/мл
Рис. 3. Зависимость протективных эффектов МП1 (серые столбцы) и МП2 (полосатые столбцы) от их концентрации в культуре нейробластомы С-1300 при токсическом действии морфина. К — контрольная культура; М — 48 ч культивирования в присутствии 2 мМ морфина; * — р < 0.05.
*
*
*
*
0
о
о
о g*
ч у"
s g
D U
о R
я w
£
О
40 -
О *
о
20
М
МП3 МП4 МП5 МП6
Рис. 4. Протективные эффекты МПЗ—МП6 (0.01 мкг/мл) при токсическом воздействии 2 мМ морфина (48 ч) на культуру нейробластомы С-1300 (М). * -р < 0.05.
о <ч н о о
Е ^ S „
л w § g
и в
§ S
л X
3 *
В
О
50
40
30
20
10
М МН МН МН МН МН МН МН
МП1 МП2 МПЗ МП4 МП5 МП6
Рис. 5. Относительное количество (доля) живых клеток в культуре нейробластомы С-1З00 при выдерживании (48 ч) в присутствии морфина, налоксона и МП1-МП6; М — морфин в концентрации 2 мМ, МН — морфин в концентрации 2 мМ и налоксон в концентрации 0.1 мМ; МП — миелопептиды в концентрации 0.01 мкг/мл; * — р < 0.05, ** — р < 0.01.
**
* *
0
0
сичности в культуре нейробластомы также свидетельствовало об их протекторном действии (рис. 4). Налоксон не влиял на активность МП (рис. 5), что позволяет предполагать наличие иных, нежели взаимодействие с ц-опиатным рецептором, механизмов реализации их эффектов.
Депривация кислорода и глюкозы в культуре нейробластомы является моделью ишемического состояния. Была установлена корреляция между гипоксией и степенью дифференцированности клеток нейробластомы: в зонах опухолей с отсутствием или недостаточностью васкуляризации возрастает число недифференцированных клеток, что напрямую связано со злокачественностью процесса [13, 14]. Гипоксия способна вызывать дедиффе-ренцировку клеток культуры нейробластом [15, 16], причем недостаток кислорода влияет непосредственно на активность ответственных за дифферен-цировку генов [17]. Факторы, стимулирующие диф-ференцировку, обладают протективным эффектом при гипоксии и действии других повреждающих агентов [16]. Способность МП влиять на дифферен-цировку клеток позволила предположить, что они могут оказаться эффективными протекторами и при депривации кислорода и глюкозы в культуре клеток.
Для проверки данного предположения нами была проведена отдельная серия экспериментов. В этих опытах содержание живых клеток в контрольных культурах составляло 85—90%. В культурах, подвергавшихся депривации кислорода и глюкозы, наблюдалась гибель значительного числа клеток (рис. 6). Добавление миелопептидов в среду в концентрации 0.01 мкг/мл достоверно (р < < 0.01) повышало выживаемость клеток. Особенно
высокой активностью отличались МП5, МП6. В целом обнаруженные эффекты были сопоставимы с действием васкулярного эндотелиального ростового фактора, нейропротекторный эффект которого при гипоксии в культуре нейробластомы достаточно хорошо изучен [18].
В последние годы активно исследуется возможность использования трансплантации смешанной популяции клеток костного мозга при повреждениях нервной ткани, вызванных ишемиче-ским поражением, травматическим воздействием,
Рис. 6. Относительное количество (доля) живых клеток в культуре нейробластомы С-1300 в условиях депривации кислорода и глюкозы в присутствии МП1-МП6 в концентрации 0.01 мкг/мл. За 100% принимали выживаемость клеток при депривации кислорода и глюкозы (ДКГ); * -р < 0.05, ** -р < 0.01.
нейродегенеративными заболеваниями [19, 20]. При этом обнаружен выраженный протективный эффект
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.