БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 3, с. 320 - 332
УДК 578.828.6
ПРОТЕОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ДО АНТИТЕЛ ИЗ КРОВИ БОЛЬНЫХ СИНДРОМОМ ПРИОБРЕТЕННОГО ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА*
© 2006 г. Е.С. Одинцова1, М.А. Харитонова2, А.Г. Барановский1, Л.П. Сизякина2, В.Н. Бунева1, Г.А. Невинский1**
1 Институт химической и фундаментальной медицины СО РАН, 630090 Новосибирск, пр. Лаврентьева, 8; факс: (3832)333-677,
электронная почта: nevinsky@niboch.nsc.ru
2 НИИ клинической иммунологии Ростовского государственного
медицинского университета, 344022 Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29
Поступила в редакцию 29.06.05 После доработки 04.10.05
Впервые проведен анализ протеолитической активности антител (АТ) из крови больных СПИДом. Показано, что АТ проявляют особенно высокую активность к гидролизу Р-казеина и в меньшей степени гид-ролизуют обратную транскриптазу ВИЧ (ОТ), а также человеческий сывороточный альбумин (ЧСА). Проверено выполнение ряда принятых в абзимологии критериев и показано, что способность гидролизовать ОТ, ЧСА и Р-казеин является собственным свойством поликлональных АТ больных СПИДом. АТ, гидроли-зующие Р-казеин, обнаружены у 95% больных СПИДом и являются сериноподобными протеазами. Установлено, что поликлональные протеазы-абзимы существенно отличаются от типичных протеаз человека по субстратной специфичности. Отмечено, что у разных больных АТ могут проявлять различные профили зависимости протеолитической активности от рН среды. Установлено, что продукты АТ-зависимого гидролиза Р-казеина отличаются от таковых в случае трипсина, химотрипсина и протеиназы К.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: иммуноглобулины, природные абзимы, СПИД, протеолитическая активность.
Антитела (АТ) против стабильных аналогов переходных состояний, а также природные иммуноглобулины с каталитическими активностями названы абзимами и достаточно хорошо описаны в литературе [1—8]. За последние 15 лет абзимы с различными ферментативными активностями выделены из крови больных рядом аутоиммунных (АИ) заболеваний (АИЗ) [4—8]. Первым примером природных абзимов были ^в, выделенные из крови больных бронхиальной астмой, которые гидролизовали вазоактивный интестинальный пептид [9]. Затем в крови больных системной красной волчанкой (СКВ) были обнаружены с ДНКазной [10] и РНКазной активностями [11—13]. Описаны также антите-
Принятые сокращения: АТ — антитела, АИ — аутоиммунные, АИЗ — аутоиммунные заболевания, ВИЧ — вирус иммунодефицита человека, СКВ — системная красная волчанка, ОТ — обратная транскриптаза, ЧСА — человеческий сывороточный альбумин.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 05-155, 25.12.2005.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
ла и/или 1яМ, гидролизующие ДНК, РНК [11, 14—17] и полисахариды [18, 19], выделенные из крови пациентов с различными АИЗ (СКВ [11], тиреоидит Хашимото [20], полиартрит [16], рассеянный склероз [21—23], лимфопролифера-тивные заболевания [14], полиневриты, злокачественные опухоли [18, 19], а также два вирусных заболевания: вирусный гепатит [17] и СПИД [15]).
Известны больных АИЗ, которые гидро-лизуют аутоантигенные белки — тиреоглобулин (тиреоидит Хашимото и ревматоидный артрит) [24, 25], протромбин (множественная миелома) [26], белковый фактор VIII (гемофилия) [27] и основной белок миелина (рассеянный склероз; антитела ^в, ^М и 1яА) [28-30].
В молоке здоровых рожениц были обнаружены sIgA с нуклеазной [7, 31, 32], АТРазной [33, 34], протеинкиназной [35, 36] и полисахарид-гидролизующей [37] активностями. Согласно совокупности данных ряда работ во время беременности и особенно после начала лактации организм женщины временно характеризуется иммунным статусом, сходным с таковым для боль-
ных АИЗ ([38] и ссылки в ней). В то же время, согласно нашим данным, АТ из крови здоровых доноров, а также больных гриппом, пневмонией, туберкулезом, тонзиллитом, язвой 12-перстной кишки и некоторых онкобольных (раки матки, молочной железы, кишечника, протекающие без существенных нарушений иммунного статуса) не проявляли заметной каталитической активности [7, 38, 39].
СПИД — Вирусное заболевание, приводящее к дисфункции иммунной системы [40]. Выраженный иммунный ответ на компоненты вируса является важнейшим фактором, определяющим медленное развитие ВИЧ-инфекции до стадии СПИДа, приводящей к прогрессирующему снижению числа Т-хелперов и их функциональной недостаточности. Активация В-лимфоцитов при ВИЧ-инфекции приводит к гипергаммагло-булинемии, появлению в сыворотке иммунных комплексов и ауто-АТ. Структурное сходство между консервативными участками молекул HLA классов I и II и вирусными гликопротеида-ми яр120 и gp41 может быть причиной появления ауто-АТ к HLA. Хотя системные АИ-реак-ции при ВИЧ-инфекции развиваются редко, отдельные АИ-нарушения (лимфопения, нейтро-пения, анемия и тромбоцитопения) лежат в основе клинических проявлений СПИДа. Чаще всего вырабатываются АТ к лимфоцитам, реже — к тромбоцитам и нейтрофилам. У ВИЧ-инфицированных выявлены также антинуклеарные АТ, антитела к кардиолипину, интерлейкину ГЬ-2, молекулам CD4 и CD8 и некоторым сывороточным белкам: иммуноглобулинам, тиреоглобули-ну [41]. После поликлональной активации лимфоцитов наступает их физический дефицит.
В данной работе проведено исследование протеолитической активности ^О антител из крови больных СПИДом.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Выделение антител. ^О антитела были выделены из крови 110 больных в возрасте от 18 до 40 лет, из которых согласно классификации Центра по контролю и профилактике болезней 45 находились на стадии генерализованной лимфаде-нопатии, 65 — в стадии пре-СПИДа. Венозную кровь, отобранную у пациентов натощак, смешивали с 4%-ным цитратом натрия в соотношении цитрат/кровь 1 : 4. Полученную смесь выдерживали 3—5 ч и центрифугировали при 3000 g 15 мин. Для осаждения белков к 1 мл полученной плазмы крови добавляли равный объем 50 мМ ТЙ8-НС1, рН 7,5, содержавшего 150 мМ №С1 и сульфат аммония, до 50%-ного насыще-
ния. Осадок после 1 ч инкубации при 5° отделяли центрифугированием (12 000 g, 10 мин), растворяли в 1 мл буфера 50 мМ Тга-НС1, pH 7,5, содержавшего 150 мМ NaCl, и диализовали 12 ч против этого же буфера при 4°.
Диализованную фракцию суммарных белков крови центрифугировали, и супернатант наносили на колонку с Protein A-Sepharose (1 мл), уравновешенную буфером А (50 мМ Тris-HQ, pH 7,5, 150 мМ NaCl). Белки, не взаимодействующие с сорбентом, отмывали тем же буфером до полного исчезновения поглощения при 280 нм. Неспецифически адсорбированные белки и липи-ды элюировали буфером А, содержавшим 1%-ный Triton X-100, и колонку промывали 50 мМ TOs-HCl-буфером, pH 7,5, содержавшим 0,3 М NaCl. Суммарную фракцию АТ, содержавшую IgG, IgA и IgM, элюировали 0,1 М глицин-HCl, pH 2,6, и сразу после выхода с колонки фракции АТ нейтрализовали 1,5 М TOs-HCl, рН 8,0. АТ диализо-вали против буфера А.
Разделение IgG, IgA и IgM проводили с помощью высокоэффективной гель-фильтрации на колонке Superdex 200 HR 10/30 (100 х 300 мм) (хроматограф Sprint Biocad, «Pharmacia», Швеция), уравновешенной 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, содержавшим 0,3 М KCl. Перед FPLC гель-фильтрацией для диссоциации комплексов 250 мкл раствора АТ (~1 мг/мл) смешивали с 83 мкл 3 М MgCl2 и 166 мкл 3 М NaCl, выдерживали 30 мин, центрифугировали (10 мин, 10 000 g). Перед нанесением образца на колонку наносили 2 мл буфера, содержавшего 0,5 М MgCl2 и 1 М NaCl, а затем раствор АТ. Элюцию проводили 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5 (0,2 мл/мин). Использование инкубации АТ с солями высоких концентраций обеспечивало эффективное разделение белков.
Дополнительную очистку АТ проводили с помощью аффинной хроматографии на колонке с казеин-сефарозой (1 мл, 5 мг казеина на 1 мл смолы). АТ (1,5 мг) наносили на колонку, уравновешенную 50 мМ Тris-HQ-буфером, pH 7,5, или этим же буфером, содержавшим 0,1 М KCl, и Ig элюировали градиентом KCl (0—1 М) в этом же буфере.
Выделение казеина из молока человека. Частично очищенный казеин получали из молока рожениц следующим образом. Молоко (0,5 л) центрифугировали 40 мин при 8000 g, супернатант отбирали и диализовали против 300 hM NaOAc, рН 3—4, в течение ночи (6°) [35]. Затем осадок отделяли центрифугированием (40 мин при 10 000 g), промывали 0,3 M №ОАс, рН 3—4 и центрифугировали (15 мин при 7000 g). Полученный осадок растворяли в 50 mM №ОН, содержавшем 1,5 М NaCl. Высокоочищенные препараты казеина получали высокоэффективной гель-фильтрацией на
колонке c Superdex-75, уравновешенной тем же буфером. Фракции, соответствующие казеину, концентрировали с помощью Centricon YM-10 (1000 g, 4°) до конечной концентрации 1—2 мг/мл.
Электрофоретический и иммунологический анализ белков. Электрофоретический анализ белков проводили методом Лэммли [42] в 4-15%-ном градиентном или 12,5%-ном обычном ПААГ. Белки инкубировали в 50 мМ Tris-HCl, рН 6,8, содержавшем 2%-ный Ds-Na, 10%-ный глицерин и 0,025%-ный бромфеноловый синий, 1 мин при 100° и наносили на гель. Электрофорез проводили 3—4 ч при силе тока 15—20 мА. Белки окрашивали AgNO3 [43] либо кумасси R-250 [44].
При анализе АТ с помощью иммуноблоттин-га после электрофореза осуществляли блот-пе-ренос белков на нитроцеллюлозную мембрану, АТ окрашивали с помощью конъюгата специфических АТ с пероксидазой хрена [45]. Контрольную нитроцеллюлозную мембрану промывали 3 раза водой и окрашивали с помощью следующей смеси: 20 мл свежеприготовленного раствора, содержавшего 550 мг цитрата натрия, 190 мг FeSO4, 40 мг AgNO3 (чувствительность метода 50—100 нг/мм2).
Определение протеолитической и ДНКазной активностей антител. Реакционная смесь (20 мкл) содержала 20 мМ Tris-HCl, рН 7,5, 0,1 мг/мл казеина (или 0,1—0,3 мг/мл другого белка) и 0,05—0,2 мг/мл АТ. В качестве альтернативных субстратов использовали: а-лактальбумин, альбумин, лактоферрин, лизоцим — белки человека, а также казеин, а-лактальбумин коров, OT ВИЧ-1 и ряд других белков. Оптимальное значение рН в реакции гидролиза казеина определяли с использованием буферов (20 мМ) Mes-NaOH (pH 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0) и Tris-HCl (рН 7,5,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.