МИКРОБИОЛОГИЯ, 2008, том 77, № 6, с. 725-737
= ОБЗОР
УДК 577.152.344(047)
ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ ГРИБОВ: ОСОБЕННОСТИ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ПРОТЕАЗ КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ
© 2008 г. О. А. Кудрявцева*, Я. Е. Дунаевский**' О. В. Камзолкина*, М. А. Белозерский**
*Биологический факультет МГУ **НИИ физико-химической биологии им. АН. Белозерского МГУ Поступила в редакцию 22.01.2008 г.
Протеолитические ферменты грибов привлекают внимание исследователей по ряду причин, среди которых наиболее значимы их большое разнообразие, широкая субстратная специфичность, устойчивость в экстремальных условиях. Не менее интересна их функциональная роль, включающая целый ряд процессов - от гидролиза макромолекулярных субстратов в условиях крайне ограниченного содержания азотистых веществ до инициирования и поддержания процесса патогенеза. В представленном обзоре обсуждаются особенности внеклеточных протеаз ксилотрофных базидиомицетов, исключительно важной группы грибов с точки зрения функционирования биологических сообществ и участия этих грибов в процессах биодеструкции растительных отходов, к тому же интенсивно используемых человеком в качестве источника питания и лекарственных средств. Особое внимание в обзоре уделено вопросам, касающимся классификации грибных протеаз, их биохимических свойств, а также физиологической роли и регуляции активности в процессе роста грибов.
Ключевые слова: внеклеточные протеазы, грибы, базидиомицеты, ксилотрофы.
ВВЕДЕНИЕ
Протеолитические ферменты играют исключительно важную роль в обмене веществ у всех живых организмов: растений, животных, грибов, бактерий, вирусов. Изучение протеаз по праву занимает центральное положение в энзимологии, что обусловлено не только их огромным физиологическим значением, но и широким применением в научных исследованиях и в хозяйственной деятельности [1].
Анализ литературы, касающейся протеолитиче-ских ферментов микроорганизмов, свидетельствует
0 том, что протеазы грибов изучаются, главным образом, в трех основных случаях: 1) если имеется перспектива их использования в хозяйственной деятельности или медицинской практике; 2) если они могут выступать в качестве факторов патогенности возбудителей болезней растений, животных или человека; 3) если их продуценты являются модель-
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: dun@belozersky.msu.ru). Использованные сокращения: РНМВ - и-гидроксимерку-рийбензоат; РСМВ - и-хлормеркурийбензоат; EDTA - эти-лендиаминтетраацетат; DAN - метиловый эфир диазоаце-тил-ОЬ-норлейцина; MDAH - метил-2-диазоацетамидгекса-ноат; EPNP - 1,2-эпокси-3-(и-нитрофенокси)пропан; S-PI -ингибитор пепсина из Streptomyces; PMSF - фенилметилсуль-фонилфторид; DCI - 3,4-дихлоризокумарин; APMSF - (и-ами-динофенил)-метилсульфонилфторид; TPCK - тозилфенил-аланинхлорметилкетон; SucAAPFpNA - N-сукцинил-аланил-аланил-пролил-фенилаланил-и-нитроанилид; SucAAPLpNA -N-сукцинил-аланил-аланил-пролил-лейцил-и-нитроанилид, BTEE - этиловый эфир бензоилтирозина, Z - карбобензок-си, ZFLAA - Z-Phe-Leu-Ala-Ala.
ными объектами для изучения физико-химических свойств и биологической роли синтезируемых ими ферментов. В любом из этих случаев важнейшими объектами исследований являлись микромицеты. Однако в последние годы в рамках выполнения первой задачи заметно вырос интерес к такой разнообразной и важной с экологической точки зрения группе грибов как базидиальные макромицеты, и встала задача систематизации и анализа имеющихся данных.
Ксилотрофные базидиомицеты - исключительно важная группа с точки зрения функционирования биологических сообществ. Кроме того, эти грибы издавна используются человеком в качестве источника питания и лекарственных средств. Именно они составляют большую часть культивируемых в промышленных масштабах видов грибов. Ксилотрофные базидиомицеты, будучи в большинстве случаев грибами, разрушающими древесину, образуют ряд внеклеточных целлюлолитических, ксиланолитиче-ских (разрушающих гемицеллюлозу) и лигнолити-ческих ферментов, изученных достаточно хорошо и подробно [2]. При этом следует отметить, что, хотя секреция протеолитических ферментов играет существенную роль в жизнедеятельности этих организмов, поскольку основным источником азота в древесине являются белки, выяснению роли протеаз в жизнедеятельности ксилотрофных грибов уделено намного меньше внимания.
В настоящее время, с целью получения плодовых тел в качестве источника питания, во многих стра-
нах мира широко культивируются различные виды рода Pleurotus. Эти грибы имеют крупные плодовые тела и обладают приятным вкусом. Помимо хороших пищевых качеств [3], они обладают рядом полезных медицинских свойств, что обусловлено наличием у них биологически активных веществ, оказывающих положительное терапевтическое действие на человека. Многочисленные исследования показали, что представители этой группы грибов проявляют антиоксидантную [4], иммуномодулирующую и противоопухолевую активность [5-8], противопа-разитарное и антибактериальное действие [9, 10].
Обращает на себя внимание тот факт, что наибольший процент видов с активным противоопухолевым действием был обнаружен среди древораз-рушающих грибов: Lentinus (L.) edodes, Flammulina (F.) velutipes, Inonotus obliquus, Pleurotus (P.) ostrea-tus, Pholiota nameko, Ganoderma (G.) lucidum, Tram-etes (T.) versicolor, Schizophyllum commune и др. Целый ряд исследований показывает, что, помимо раковых заболеваний, грибные вещества эффективны и при лечении других болезней. Кроме того, соединения, выделенные из съедобных грибов, обладают низкой токсичностью для человека и хорошо переносятся по сравнению с препаратами синтетического происхождения [7, 11].
Внимание исследователей привлечено и к фиб-ринолитической активности этой группы грибов. Накопление фибрина в кровеносных сосудах часто приводит к тромбозу, что может служить причиной инфаркта миокарда и других сердечнососудистых заболеваний. Фибринолитические ферменты, производимые микроорганизмами, вызывают большой интерес у исследователей благодаря их невысокой стоимости и отсутствию нежелательных побочных эффектов [12, 13].
Способность гидролизовать фибрин была выявлена для экстрактов из плодовых тел и мицелия многих базидиальных грибов, принадлежащих к различным таксономическим группам [14]. Из плодовых тел P. ostreatus удалось выделить 7п2+-зависи-мую металлопротеазу, гидролизующую не только фибрин, но и ß- и у-цепи фибриногена человека. При этом фермент не расщеплял азоказеин, азоаль-бумин и эластин [15].
В последние годы, благодаря относительной легкости культивирования, хорошим потребительским качествам и ценным медицинским свойствам, ксило-трофные базидиомицеты стали предметом всестороннего изучения. В настоящее время достаточно широко изучаются секретируемые протеолитиче-ские ферменты грибов, принадлежащих к различным экологическим группам, исследуются как их физико-химические свойства, так и роль в жизнедеятельности грибных организмов. Однако сведения о протеазах грибов-ксилотрофов практически не систематизированы. В связи с большой функциональ-
ной и практической значимостью этих ферментов встает задача обобщения литературного материала.
СРАВНИТЕЛЬНАЯ БИОХИМИЯ СЕКРЕТИРУЕМЫХ ПРОТЕАЗ КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ
Отсутствие достаточного количества систематизированных знаний о секретируемых протеазах высших ксилотрофных грибов можно считать большим пробелом в изучении биологии этой группы, так как протеолитические ферменты играют незаменимую роль в обеспечении азотного питания ксилотрофов в их естественных условиях роста - на живой или мертвой древесине. Древесина выполняет не только механические и проводящие функции, но и представляет собой зону накопления резервных веществ, в том числе и азотсодержащих. Хорошо известно, что основная масса азотсодержащих соединений в древесине представлена белками, локализующимися в живых элементах ксилемы, а также ассоциированными с материалом клеточных стенок древесины. Содержание белка в древесной породе может изменяться в зависимости от географического положения и части дерева [16]. В древесных тканях минеральный азот также имеется, но его содержание чрезвычайно мало [17, 18]. Белки, являясь основным источником азота в древесине, по-видимому, обуславливают существенную роль внеклеточных протеолитических ферментов в жизнедеятельности ксилотрофных грибов.
Структурно-функциональные особенности про-теаз базидиальных грибов начали изучаться около 30 лет назад. Среди литературных источников имеются работы, посвященные выделению и характеристике протеолитических ферментов из культивируемого мицелия и плодовых тел базидиальных макромицетов и попыткам их классификации. Следует заметить, что протеазы плохо подчиняются обычным правилам номенклатуры ферментов по причине огромного разнообразия их структуры и механизмов действия. Поэтому классификация этих ферментов часто представляет значительные трудности. Один из основных принципов классификации протеолитических ферментов - принцип субстратной специфичности. Согласно данному критерию все протеолитические ферменты делятся на две большие группы: экзопептидазы и эндопептидазы.
Для работы экзопептидаз необходимо присутствие вблизи расщепляемой связи свободных концевых групп. Аминопептидазы найдены у большого числа разнообразных микроорганизмов, включая грибы и бактерии. В большинстве случаев аминопептидазы - внутриклеточные ферменты, хотя имеются немногочисленные сообщения об обнаружении внеклеточных аминопептидаз у грибов. В частности, в культуральной жидкости трутовика T. trogii (помимо эндопептидазной активности) обнаружены
аминопептидазная, карбоксипептидазная и дипепти-дил-аминопептидазная активности [19].
Эндопептидазы (протеиназы, пептидил-пептид-гидролазы) расщепляют внутренние пептидные связи в белках. Их разделяют на подгруппы, в первую очередь, на основании строения каталитического центра, проводя в большинстве случаев идентификацию функциональных групп, образующих активный центр, с помощью специфических ингибиторов. Основываясь на строении активного центра, протеиназы делят на четыре подгруппы: сериновые [имеют
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.