БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2007, том 24, № 6, с. 479-489
УДК 577.121.7;616.831:616-092.9
ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ В МИТОХОНДРИЯХ, ЯДРАХ,
ЛИЗОСОМАХ И ЦИТОЗОЛЕ НЕОКОРТЕКСА, МОЗЖЕЧКА И ГИППОКАМПА КРЫС ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ БЕТА-АМИЛОИДА
© 2007 г. Ю. Г. Каминский12, Н. И. Бенедиктова2, И. Н. Соломадин3, Н. Б. Маров3, Е. А. Косенко2
1Институт биологического приборостроения РАН, Пущино, Россия 2Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино;
факс: (496) 7330553; электронная почта: kaminsky@iteb.ru 3Пензенский государственный педагогический университет им. В.Г. Белинского, Пенза
Поступила в редакцию 27.12.2006 г.
После доработки 10.04.2007 г.
Исследовали действие Р-амилоидного пептида (AP) на протеолитические ферменты в митохондриях, ядрах, лизосомах и цитозоле неокортекса, мозжечка и гиппокампа крыс. Показано, что после введения Ap25_35 в головной мозг повышается активность каспазы-9 и каспазы-3 в митохондриях и цитоплазме неокортекса, мозжечка и гиппокампа, кальпаина-1 и кальпаина-2 в митохондриях и лизосомах неокортекса и гиппокампа. Под влиянием Ap25-35 нелизосомные кальций-зависимые тио-ловые протеазы кальпаин-1 и кальпаин-2 появляются в митохондриях и лизосомах, а лизосомные катепсины В и D, а-галактозидаза и Р-галактозидаза - в цитозоле. Повышение активности всех про-теолитичеких ферментов в субклеточных фракциях свидетельствует об их переносе через внутриклеточные мембраны и возможном участии в протеолизе белков в субклеточных отделах нейрона in vivo под влиянием вводимых Р-амилоидных пептидов и при нейродегенеративных болезнях.
в-Амилоидные пептиды (Ав) - низкомолекулярные продукты протеолиза высокомолекулярного трансмембранного белка-предшественника Ав (АРР) и главные компоненты альцгеймеров-ских амилоидных отложений в головном мозге [1, 2]. Эти сенильные бляшки концентрируются на наружной поверхности мембраны нейрона, хорошо видны под световым микроскопом, а образующие их наноразмерные Ав инициируют медленную дегенерацию нервных клеток при болезни Альцгей-мера (БА) и других нейродегенеративных заболеваниях.
Патофизиология БА, а также молекулярные и клеточные механизмы токсического действия Ав выяснены не до конца. Одной из причин развития нейродегенеративных процессов в головном мозге при БА [3] и в культуре нервных клеток, подверженных действию Ав [4], считается окислительный стресс во внутриклеточных отделах, а одной из мишеней активных кислородных метаболитов (АКМ) - ядерная ДНК. Токсическому действию Ав предшествует их проникновение через клеточную мембрану в цитоплазму нейрона.
Молекулярные механизмы токсичности Ав изучают на животных. Однако у грызунов амилои-догенный путь процессинга АРР выражен крайне слабо, а собственные Ав не способны образовывать высокомолекулярные агрегаты и амилоидные бляшки [5]. Поэтому при работе с животными
основным экспериментальным приемом является внутрижелудочковое введение синтетических Ар.
Введение Ав животным в желудочки мозга, т.е. во внеклеточное пространство, приводит к накоплению Ca2+ в митохондриях, цитоплазме и клеточных ядрах нейронов, к нарушению окислительного фосфорилирования в митохондриях [6, 7]. Такие же изменения наблюдаются in vitro при добавлении Ав в среду инкубации митохондрий мозга [8] и in vivo в митохондриях мозга трансгенных мышей Tg2576, несущих ген АРР человека [9]. Культивируемые нервные клетки человека испытывают апоптоз в присутствии Ав [10-12]. Предполагалось, что при действии Ав in vivo в нейронах тоже развиваются апоптотические процессы и интенсифицируется каспазный каскад [13], разрушающий клетку. Важнейшая роль в этом каскаде принадлежит цитоплазматическим цистеиновым проте-азам - каспазе-9 и каспазе-3. После связывания с фактором Apaf-1 (apoptosis protease activating factor-1, фактор 1 активации апоптотических протеаз), которое возможно только в присутствии цитохро-ма с и ATP в цитоплазме, неактивная прокаспаза-9 превращается в активную каспазу-9, способную расщеплять и тем самым активировать прокаспа-зу-3 [13]. Каспаза-3 может прямо участвовать во фрагментации ДНК [14] или активировать эндо-нуклеазы, в том числе активируемую каспазой ДНК-азу (КАД). Участие цитоплазматических каспаз в ядерных процессах может быть оценено
по переносу протеаз через ядерную мембрану или по распределению их активности между цитозо-лем и ядром. Изменяется ли активность каспаз в субклеточных фракциях нейронов мозга под влиянием эндогенных или экзогенных Ав, пока неизвестно. Выяснение этого и составило одну из задач нашей работы.
Накопление Ca2+ в цитозоплазме нейрона, вызванное Ар, ведет к активации других нелизосом-ных кальций-зависимых протеолитических ферментов - кальпаинов [15]. Важную роль кальпаи-ны играют и в патогенезе нейродегенеративных болезней [16]. Они могут полностью расщеплять растворимые и структурные белки в мозге, повреждать мембранные структуры в нервных клетках, разрушать лизосомные мембраны, способствовать высвобождению в цитоплазму лизосомных катеп-синов и дальнейшему усилению внутриклеточного протеолиза вплоть до отмирания клетки.
Прямое измерение активности кальпаинов и катепсинов В и D в субклеточных структурах мозга в норме и при действии Ав in vivo, насколько нам известно, не проводилось, поэтому получение таких данных составило вторую задачу нашей работы. Вызванный Ав протеолиз некоторых белков цитоскелета в нейроне in vitro связывали с активацией каспазы-3 и кальпаинов [17], но доказательства такой связи отсутствуют (хотя косвенных данных достаточно, например, [18]).
Многочисленные исследования, проведенные на животных, показали, что морфологические и биохимические изменения, характерные для головного мозга больных БА, развиваются медленно и наблюдаются только после длительного введения Ав - обычно в течение 7-14 дней [19, 20]. В наших экспериментах введение крысам Ав25-35 приводило к постепенному усилению образования Н2О2 в митохондриях неокортекса в течение 5-14-го дней, но почти не оказывало влияния в первые 3 сут [21].
Целью представленной работы была проверка гипотезы, согласно которой Ав запускает проте-азный каскад в нейроне: кальций —»- нарушение функций митохондрий —► каспаза-9 —► каспаза-3 —»- кальпаины —»- повреждение лизосом —► выход лизосомных протеаз —► протеолиз. Мы изучали влияние длительного введения в мозг крысам Ав25-35 на распределение активности каспазы-3, каспазы-9, кальпаина-1, кальпаина-2, катепсинов В и D между митохондриями, лизосомами, клеточными ядрами и цитоплазмой, выделенными из разных отделов головного мозга. Противоположно направленные изменения активности ферментов в разных субклеточных фракциях могут указывать на повреждение внутриклеточных мембран и принципиальную возможность переноса ферментов через поврежденные мембраны. Все измерения выполняли на 7-й и 14-й дни непрерывного введения Ав жи-
вотным в желудочки мозга с постоянной скоростью.
Предварительные результаты доложены на конференции [22].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы. NAD, NADH, NADPH, EDTA, EGTA, ô-нитротетразолиевый синий, метилено-вый синий, пероксидаза хрена, DL-дитиотреитол (ÑTT), цианид калия, феррицианид калия, фенил-метилсульфонилфторид (îMCî), какодилатный буфер, перколл, aгapoзa, DEAE-целлюлоза, сукци-нат калия, пируват натрия, глюкозо-б-фосфат, AMP, ацетилтиохолиниодид, ацетат натрия, глицерин, глицин, цитрат, тритон X-100, твин 20, о-фе-нилендиамин, дитио-бмс-нитробензоат (ДГИВ), лейпептин, пепстатин, апротинин, бычий сывороточный альбумин ^CA), каспаза-3, катепсин В, гемоглобин, N-сукцинил-лейцил-лейцил-валил-тирозил-7-амидо-4-метилкумарин (Suc-LLVY-AMC), 7-ами-до-4-метилкумарин (AMC), бензилоксикарбонил-аргинил-аргинин-7-амидо-4-метилкумарин (z-RR-AMC), N-ацетил-аспарагил-глутамил-валин-аспа-рагин-п-нитроанилид (Ac-DEVD-pNa), N-ацетил-лейцил-глутамил-гистидил-аспарагин-п-нитроани-лид (Ac-LEHD-pNa), 4-метилумбеллиферил^-га-лактозид, 4-метилумбеллиферил-а-галактозид, аминоэтилбензилсульфонилфторид, N-ацетил-О-галактозамин, Aß25-35 - фирмы "Sigma Chemical Co." (OTA); сахароза, HEPES, трис - "Serva" (Германия); ^фадекс G-25 - "Bio-Rad Lab." (OTA); тритон X-100 - "Fluka" (Швейцария).
Животные. Использовали самцов крыс Вистар массой 200-250 г. Животным вводили в головной мозг Aß25-35 непрерывно в течение 14 дней, как описано ранее [21]. Канюлю, соединенную с мини-насосом, имплантировали в IV желудочек мозга, и через 4 дня начинали вводить 15 мкл 0.9% раствора NaCl, содержащего Aß25-35. Доза Aß25-35, получаемая животным за 14 дней, составляла 5 мкг/кг массы тела; если раствор вводили менее 14 сут, то доза была пропорционально меньшей [расчеты дозы Aß25-35: около 360 нг/день/кг массы тела, либо 7090 нг/день на животное (на желудочек мозга), или 15 нг/ч/кг, или 3-3.7 нг/ч на животное]. Ложно-оперированным животным (контроль) вводили 15 мкл 0.9% раствора NaCl. Забивали крыс декапитацией.
Выделение цитоплазматической фракции и митохондрий мозга. ^ань (от трех животных) не-окортекса, мозжечка и гиппокампа гомогенизировали в 9 объемах среды, содержащей 0.25 M сахарозу, 0.5 hM EDTA и 10 мM трис, pH 7.4. Из гомогена-та получали митохондрии и цитоплазматическую фракцию [23]. Несинаптические митохондрии выделяли из общей митохондриальной фракции [24], суспендировали в буферном растворе (10 mM трис,
рН 7.5, 0.25 М сахароза) и, как и цитоплазматиче-скую фракцию, хранили при 20°С.
Выделение лизосом. Лизосомы выделяли из не-окортекса, мозжечка и гиппокампа центрифугированием в градиенте перколла методом Ошита и Кидо [25]. Ткань очищали от крови в охлажденной 0.25 М сахарозе и гомогенизировали в пяти объемах 0.25 М сахарозы. Гомогенат центрифугировали 10 мин при 1100 g и 4°С. Супернатант центрифугировали вторично в тех же условиях (10 мин при 1100 g и 4°С), а затем - 20 мин при 18000 g и 4°С. Осадок, содержащий митохондрии и лизосомы, суспендировали в 6.5 мл 0.25 М сахарозы. Затем в суспензию добавляли 4 мл 90% перколла, объем доводили 0.25 М сахарозой до 12 мл (так что концентрация перколла в смеси становилась равной 30%). Смесь центрифугировали 30 мин при 40000 g и 4°С. Фракцию, содержащую л
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.