МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 2, с. 334-341
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ^^^^^^^^^^^^ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 575.224.4
ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ АНТИРЕСТРИКЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ НЕКОНЪЮГАТИВНЫХ ТРАНСПОЗОНОВ Tn21, Tn5053, Tn5045, Tn501, Tn402
© 2015 г. Г. Б. Завильгельский1*, В. Ю. Котова1, О. Е. Мелькина1, В. П. Балабанов1, С. З. Миндлин2*
Государственный научный центр "ГосНИИгенетика", Москва 117545 2Институт молекулярной генетики Российской академии наук, Москва 123182 Поступила в редакцию 15.09.2014 г. Принята к печати 03.10.2014 г.
Конъюгативные плазмиды и конъюгативные транспозоны содержат гены, кодирующие белки, которые специфически ингибируют ферменты рестрикции-модификации типа I. В настоящей работе показано, что неконъюгативные транспозоны ТП21, ТП5053, ТП5045, ТП501, Tn402 при введении в штаммы Escherichia coli K12 проявляют антирестрикционную активность в отношении фермента EcoKI (R2M2S1) (феномен ослабления рестрикции, "RA"). Эффект RA определяется активностью белков MerR и ArdD, гены которых входят в состав транспозонов. Антирестрикционная активность транспозонов отсутствует в штаммах E. coli K12, мутантных по генам clpXи clpP, и значительно снижена в штаммах, мутантных по генам recA, recBC, а также dnaQ (mutD). Результаты представленной работы соответствуют модели, согласно которой в процессе рекомбинационной репарации и при индукции ошибок репликации в бактериальной клетке в присутствии транспозонов образуется значительное количество немодифицирован-ной ДНК; а эффект RA определяется протеолитической активностью протеазы ClpXP, специфически деградирующей R-субъединицу фермента EcoKI (R2M2S1).
Ключевые слова: антирестрикция, ферменты рестрикции-модификации типа I, неконъюгативный транспозон, Tn21, Tn5053, Th5045, Th501, Th402, MerR, ArdD, протеаза ClpXP.
PROTEOLYTIC CONTROL OF THE ANTIRESTRICTION ACTIVITY OF Tn21, Tn5053, Tn5045, Tn501, Tn402 NON - CONJUGATIVE TRANSPOSONS, by G. B. Zavilgelsky1*, V. Yu. Kotova1, O. E. Melkina1, V. P. Balabanov1, S. Z. Mindlin2** (1State Research Center "GosNIIgenetika", Moscow, 117545 Russia; *e-mail: zavilgel@genetika.ru; 2Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Science, Moscow, 123182 Russia; e-mail: mindlin@img.ras.ru). Conjugative plasmids and conjugative transposons contain the genes, which products specifically inhibit the type I restriction — modification systems. Here is shown that non-conjugative transposons Tn21, Tn5053, Tn5045, Tn501, Tn402 partially inhibit the restriction activity of the type I restriction-modification endonuclease EcoKI (R2M2S1) in Escherichia coli cells K12 (the phenomenon of restriction alleviation, RA). Antirestriction activity of the transposons is determined by the MerR and ArdD proteins. Antirestriction activity of transposons is absent in mutants E. coli K12 clpX and clpP and is decreased in mutants E. coli K12 recA, recBC and dnaQ (mutD). Induction of the RA in response to the MerR and ArdD activities is consistent with the production of unmodified target sequences following DNA repair and DNA synthesis associated with recombination repair or replication errors. Ra effect is determined by the ClpXP-depen-dent degradation of the endonuclease activity R subunit of EcoKI (R2M2Sj).
Keywords: antirestriction, type I restriction-modification enzymes, non-conjugative transposon, Tn21, Tn5053, Tn5045, Tn501, Tn402, MerR, ArdD, protease ClpXP.
DOI: 10.7868/S0026898415020172
Конъюгативные плазмиды и конъюгативные транспозоны содержат гены аМЛ и атйВ, кодирующие антирестрикционные белки ЛгёЛ и ЛгёБ, которые специфически ингибируют ферменты рестрикции-модификации типа I [1—6]. Белки се-
* Эл. почта: zavilgel@genetika.ru; mindlin@img.ras.ru
мейства ЛМА ингибируют одновременно ре-стрикционную (эндонуклеазную) и модификаци-онную (метилазную) активности ферментов [3— 5], тогда как белки семейства ЛМБ действуют лишь на рестрикционную активность [6, 7]. Эти белки значительно различаются как по первичной, так и по третичной структуре. Белки АМА,
состоящие из 165—170 аминокислотных остатков, имеют значительный отрицательный заряд (—25...—30) и относятся к семейству ДНК-мимикрирующих белков, т.е. их пространственная структура сходна со структурой дцДНК в В-фор-ме [5]. Белки ArdB (141—153 аминокислотных остатка) несут, как правило, небольшой отрицательный заряд (—1.. .—6) и имеют форму компактного тетраэдра [7]. Гены ardA и ardB помогают мобильным элементам преодолевать рестрикционные барьеры и тем самым обеспечивать эффективный "горизонтальный" перенос генов между бактериями различных видов и родов.
Показано [8], что цельный ртутный неконъ-югативный транспозон Tn5053, содержащий два оперона, — ртутный merRTPFADL и противоположно направленный оперон транспозиции tni-ABQR, если его ввести в клетку Escherichia coli K12 в составе вектора pUC19, снижает рестрикционную активность EcoKI типа I примерно в 200—400 раз (эффект ослабления рестрикции, RA — Restriction Alleviation) [8]. Был клонирован новый ген ardD, расположенный внутри tniA (кодирует транспозазу TniA), причем продукт гена ardD проявляет антире-стрикционную активность в отношении EcoKI [8]. Ранее был обнаружен антирестрикционный эффект гена merR (кодирует белок-репрессор оперона mer, определяющего резистентность бактерий к ионам ртути), введенного в штамм E. coli K12 в векторе pUC, в отношении рестриктазы EcoKI [9]. В нашей работе определена антирестрикционная активность неконъюгативных транспозонов Tn21, Tn5053, Tn5045, Tn501, Tn402 и изучено влияние протеазы ClpXP, а также генов recA, recBC, dnaQ и dam на их антирестрикционную активность. Показано, что антирестрикционная активность транспо-зонов отсутствует в штаммах E. coli, мутантных по генам clpX и clpP, и значительно снижена в штаммах, мутантных по генам recA, recBC, dnaQ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Бактериальные штаммы, бактериофаги и плаз-
миды. Описание бактериальных штаммов и плаз-мид приведено в табл. 1.
Бактериофаг ^vir получен от R. Devoret, Франция. Немодифицированные фаги ^.0 и модифицированные фаги ^.K выращивали на клетках E. coli TG-1 и E. coli K12 AB1157 соответственно.
В работе использовали векторы pTZ57R, pUC19 и pACYC184. Гены оперона merRTPFADL (фрагмент ДНК Tn5053 размером около 4 т.п.н.) встроили по сайтам ClaI—SalGI в вектор pACYC184 и получили гибридную плазмиду, названную pAC-mer. Ген ardD транспозона Tn21 был встроен в вектор pTZ57R с использованием праймеров:
tniTn21D 5'-GTATAAACCGTCCAAGAAATCGT-3' и
tniTn21R 5'-GACCAAACTATCGTGCGGGCG-3'. Гибридная плазмида названа pardD-Tn21.
Среды, ферменты, реактивы. Использовали LB-среду: 1% триптона, 0.5% дрожжевого экстракта и 0.5% NaCl. Для верхнего и нижнего слоев чашек Петри использовали 1.8 и 0.7%-ный LB-агар. Бактерии растили при 30°C в среде LB или LB с антибиотиками — 100 мкг/мл ампициллина, 40 мкг/мл канамицина, 25 мкг/мл хлорамфеникола, при постоянном перемешивании до достижения средней экспоненциальной фазы роста.
Эндонуклеазное расщепление, лигирование фрагментов ДНК, электрофорез в агарозном геле и выделение фрагментов ДНК из геля проводили согласно [13]. В реакциях расщепления и лигирования использовали ферменты фирмы "Fermentas" (Литва). Клетки E. coli трансформировали методом электропорации.
Облучение фага и бактерий. Суспензию фага X и бактерий в Трис-буфере облучали лампой БУВ-30 (254 нм). Дозу УФ-излучения измеряли дозиметром УФД-4 с магниевым фотоэлементом. Адсорбцию фагов на необлученных и облученных клетках E. coli AB 1157 проводили в ТМ-буфере (0.05 М Трис-HCl, 0.01 M NaCl, 0.01 M MgSO4) при 37°C в течение 20 мин. Комплекс фаг-бактерия высевали двухслойным методом с добавлением индикаторной культуры AB2463.
Измерение антирестрикционной и антимодифика-ционной активностей транспозонов Th21, Th5053, Th5045, Th501, Th402 и белков ArdD и MerR. Анти-рестрикционные активности транспозонов и белков MerR и ArdD измеряли с использованием штамма E. coli K-12 AB1157 с активной системой рестрикции-модификации типа I EcoKI. Антимо-дификационную активность транспозона Tn5053 измеряли на штамме E. coli K12 JM109 r-m+ с активной EcoKI-метилазой. Методика измерения анти-рестрикционной и антимодификационной активности у белков семейства Ard описана в [14, 15].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Антирестрикционные активности транспозонов
Th21, Th5053, Th5045, Th501, Th402
Антирестрикционную активность определяли с использованием нескольких транспозонов различного типа, содержащих гены merR и ardD в различных сочетаниях. При этом транспозоны Tn21 и Tn5053 содержали оба гена, тогда как Tn501 — только ген merR , а Tn402—только ardD. В состав Tn5045, в отличие от остальных транспозонов, входит, кроме гена ardD, оперон устойчивости к хрому (cAr-оперон). Необходимо отметить также, что транспозоны Tn21, Tn5045, Tn402 кодируют белок ArdD, укороченный на 26 С-концевых остатков по сравнению с ArdD Tn5053 (в табл. 2 ген, кодиру-
Таблица 1. Бактериальные штаммы и плазмиды
Штамм Генотип Источник или ссылка
AB1157 ¥~thr-1, leu-6, proA2, his-4, thi-1, argE3, lacYl, galK2, ara14, xyl-5, mtl-1, tsx-33, rpsL31, supE44 ВКПМ "ГосНИИгенетика"
JM109 recA1 endA1 gyrA96thi supE44 relA1 hsdR17 A(lac-proAB) [F'traD36 proAB lacIqZ AM15] ВКПМ "ГосНИИгенетика"
TG-1 thi relA supE44 hsdR17 hsdM A(lac-proAB) [F'traD36 proAB lacIqZ AM15] ВКПМ "ГосНИИгенетика"
JC7623 AB1157 recB21 recC22 sbcB15 ВКПМ "ГосНИИгенетика"
AB2463 AB1157 recA13 ВКПМ "ГосНИИгенетика"
NK113 AB1157 AclpP::cat N.E. Murray, Эдинбургский университет, Шотландия
NK114 AB1157 AclpX::kan N.E. Murray, Эдинбургский университет, Шотландия
VK0013 AB1157 dam::kan Данная статья
VK0014 AB1157 dnaQ (mutD)::kan Данная статья
BW25113 lacIqrmB3 AlacX4787hsdR5114 AaraBAD567 "Keio Collection"
JW3350 BW25113 dam::kan "Keio Collection"
JW0205 BW25113 dnaQ744(del)::kan "Keio Collection"
pUB837 Tcr Apr Spr Sur Hgr (pBR322::Tn21) [10]
pVS982 Tcr Apr Hgr (pBR322::Tn501) [10]
pKLH53.1 (pUC19 ::Tn5053) [11]
pKLH402.1 (pUC19::Tn402) [11]
pKLH45.1 pGEM-7Zf(-)::Tn5045 [12]
pTLORF5 (pUC19 с клонированным по сайтам KpnI—Sall 2300
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.