m
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2003, том 29, № 5. с. 486^94
УДК 577.152.342*153.134
ПРОТЕОЛИЗ, СОПРЯЖЕННЫЙ С ГИДРОЛИЗОМ АТР. РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ЦЕНТРОВ Lon-ПРОТЕИНАЗЫ
Escherichia coli
© 2003 г. К. Б. Цирульников, Э. Э. Мельников, Т. В. Ротанова*
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, ГСП, Москва, В-437, ул. Михлухо-Маклая, 16110 Поступила в редакцию 10.10.2002 г. Принята к печати 15.10.2002 г.
Изучена регуляция активности протеолитических центров Lon-протеиназы. Установлено, что ATP-Mg проявляет свойства неконкурентного активатора пептидазных центров фермента. Экспериментально подтвержден процессивный механизм гидролиза белковых субстратов Lon-протеиназой в условиях гидролиза АТР. Показано, что необходимым фактором процессивного протеолиза нативной Lon-протеиназой является олигомерность фермента. Исследованием свойств смешанного мутанта Lon-K362Q/S679A подтверждено существование внутрисубъединичного и межсубъединичного путей передачи сигнала от АТР-азных центров к протеолитическим. Изучено взаимовлияние субстратов Ьоп-протеиназы; высказано предположение о существовании кооперативных взаимодействий между пептидазными центрами в олигомере фермента.
Ключевые слова: ААА+-белки; АТР-зависимый протеолиз; протеиназа Lon; пептидазный центр; регуляция; Е. coli.
ВВЕДЕНИЕ
Селективный протеолиз - важнейший механизм поддержания внутриклеточного гомеостаза -осуществляется ААА+-протеиназами, относящимися к сообществу ААА+-белков (АТР-аз, ассоциированных с различными клеточными активностями) [1-6]. Внутриклеточные ААА+-протеи-назы выполняют функции регуляции клеточного метаболизма путем расщепления короткоживу-щих регуляторных белков и деградации дефектных полипептидов, образующихся в результате ошибок транскрипции или трансляции, химического повреждения, неправильного сворачивания или действия стрессогенных факторов [7-10].
Ьоп-протеиназа Е. coli (далее Ьоп-протеиназа, КФ 3.4.21.53, классификация MERO PS ID: S16.001), первая обнаруженная ААА+-протеиназа, представляет собой цитоплазматический гомоолиго-мерный фермент, субъединица которого (784 а.о.) содержит три функциональных домена: TV-конце-вой, предполагаемая функция которого - участие в селективном взаимодействии с белками-мишенями, центральный - АТР-азный и С-концевой -протеолитический [11-13]. Ранее был идентифицирован каталитически активный остаток проте-
Сокращения: РерТВЕ - Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl; Lon-w.t. -нативная Ьоп-протеиназа; АМР-СРР - a.ß-метиленадено-зин-5'-трифосфат.
# Автор для переписки (тел.: (095) 335-42-22; эл. почта: rotanova@enzyme.siobc.ras.ru).
олитического центра - Ser679 [14], однако наличие в Ьоп-протеиназе классической триады (Ser-His-Asp) не получило подтверждения [15], в связи с чем было выдвинуто предположение о возможном функционировании каталитической диады Ser-Lys в активном центре фермента [15]. Недавно получены доказательства принадлежности Ьоп-протеиназы к неклассическому семейству сериновых протеиназ с каталитической диадой Ser679-Lys722 в протеолитическом активном центре (клан SF в классификации MEROPS) [16].
Ьоп-протеиназа (как и другие известные к настоящему времени АТР-зависимые протеиназы Е. coli-ClpAP, ClpXP, FtsH и HslUV [17-20]) обладает следующими характерными свойствами: (1) протеолитическая активность фермента сопряжена с гидролизом АТР; (2) фермент обнаруживает высокую селективность при отборе субстратов-мишеней, не проявляя выраженной первичной специфичности при их гидролизе; (3) АТР-зависимая деградация белковых субстратов происходит по процессивному механизму (без высвобождения высокомолекулярных промежуточных продуктов).
Актуальными проблемами АТР-зависимого протеолиза остаются выяснение роли сопряжения протеолиза с гидролизом АТР и механизма этого процесса, а также установление принципов селективного узнавания ферментами субстратов-мише-ней. Одним из перспективных подходов при реше-
Таблица 1. Кинетические параметры гидролиза РерТВЕ и АТР нативной Ьоп-протеиназой (Lon-w. t.) и мутантной формой Lon-K362Q
Фермент Кинетические константы Субстрат
РерТВЕ АТР*
Эффектор
- ATP-Mg AMP-CPP-Mg ADP-Mg
Lon-w. t. Кт, мМ 4.4 + 0.8 3.8 ± 0.7 3.1 ±0.5 - 0.18 ±0.04
к г"1 cat' ^ 4.7 ± 0.4 49 ±5 42 ±4 - 0.80 ±0.8
kcJKm, мМ"1 с"1 1.1 ±0.3 13 ±4 13.5 ± 4 - 4.4 ± 1.3
Lon-K362Q Кт, мМ 0.55 ±0.1 0.36 ± 0.07 1.1 ±0.2 1.0 + 0.2 0.30 ± 0.06
&cat> с 1 0.43 ± 0.04 2.0 ± 0.2 6.1 ±0.6 5.3 + 0.5 0.06 ± 0.005
ktJKm, мМ"1 с-1 0.79 ± 0.25 5.6 ± 1.7 5.6 ± 1.6 5.3 ± 1.6 0.20 ± 0.06
Условия: 50 мМ Трис-НС1-буфер, рН 8.0, 0.1 М NaCl, 37°С (при гидролизе РерТВЕ - 10% DMSO, 0.2 мМ 4,4-дитиодипиридин). Концентрации: АТР и A DP - 2.5 мМ, АМР-СРР - 0.5 мМ, MgCI2 - 20 мМ, Lon (обе формы) - 0.1 мкМ, субстрат - 30-200 мкМ. * По данным работы [21].
нии этих проблем является исследование взаимодействия протеолитических и АТР-азных центров нативных и модифицированных ферментов. Ранее нами были представлены результаты изучения in vitro АТР-азной активности Ьоп-протеина-зы, влияния на нее свободных нуклеотидов и ионов магния [21], а также данные о влиянии гидролиза АТР на функционирование пептидазных центров фермента [22].
Цель настоящей работы - изучение регуляции протеолитических центров нативной Ьоп-протеи-назы и ее мутантной формы Lon-K362Q [23], несущей замену остатка Lys362 на Gin в А-мотиве Уолкера АТР-азного центра фермента. Основное внимание уделено получению количественной характеристики активности протеолитических центров нативного и мутантного ферментов, выявлению особенностей функционирования протеолитических центров при гидролизе низкомолекулярного и белкового субстратов и выяснению вопроса, является ли олигомерное состояние фермента необходимым условием для сопряжения протеолиза с гидролизом АТР и реализации процессивного механизма протеолиза.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Количественное изучение активности протеолитических центров Ьоп-протеиназы проводилось с использованием предложенного нами ранее [24] тиоэфирного субстрата - 5ис-РЬе-Ьеи-РЬе-5Вг1 (РерТВЕ). В работе [24] показано, что активность Ьоп-протеиназы в отношении гидролиза этого низкомолекулярного субстрата является нуклео-тидрегулируемой: фермент проявляет тиоэсте-разную активность в отсутствие нуклеотидов ("базовая активность"); в присутствии комплекса
АТР-]\^ скорость гидролиза возрастает; АОР-М§ ингибирует процесс гидролиза РерТВЕ.
Вместе с тем гидролиз РерТВЕ Ьоп-протеиназой не может в полной мере отражать взаимодействие фермента с белковыми субстратами, поскольку при анализе эффективности гидролиза низкомолекулярного субстрата не может быть учтен весь комплекс взаимодействий белка-мишени и фермента. Поэтому для удобства обсуждения проблем АТР-зависимого протеолиза целесообразно различать пептидазный и протеолитический центры фермента: первый включает каталитический центр и сорб-ционный участок, обеспечивающий связывание с областью субстрата, примыкающей к гидролизуе-мой связи, а второй, кроме пептидазного центра, включает и другие участки взаимодействия фермента с белковым субстратом, в том числе локализованный в АТР-азном домене так называемый "центр узнавания" белка-мишени [21]. В связи с этим для исследования эффективности функционирования протеолитических центров Ьоп-протеина-зы наряду с низкомолекулярным тиоэфирным субстратом, позволяющим получать информацию о пептидазных центрах фермента, были использованы также олигопептидный (мелиттин) и белковый (р-казеин, далее - казеин) субстраты.
Сравнительная характеристика гидролиза РерТВЕ, мелиттина и казеина нативной Ьоп-протеиназой
Гидролиз РерТВЕ Ьоп-протеиназой был изучен как в отсутствие ATP-Mg, так и в стандартных условиях исследования фермента (при концентрациях АТР и Mg2+ 2.5 и 20 мМ соответственно). Значение Кт, определенное в отсутствие ATP-Mg, практически не меняется в присутствии нуклеотид-магниевого комплекса, однако значение ксм повы-
100
s 80
60
л h о О К
СО
¡40
* С
20
0
□
(а) (б)
1 2 3
в отсутствие нуклеотидов в присутствии ATP-Mg в присутствии AMP-CPP-Mg в присутствии ADP-Mg
Рис. 1. Активность нативной Ьоп-протеиназы (а) и ее мутантной формы Ьоп-К362(2 (б) при гидролизе РерТВЕ (1), ме-литтина (2) и казеина (5) в отсутствие и в присутствии нуклеотид-магниевых комплексов. Условия: 50 мМ Трис-НС1-буфер, рН 8.0, 0.1 М №С1, 37°С. Концентрации: нуклеотиды - 2.5 мМ, ¡У^С12 - 20 мМ.
60
40
20
•wL
(а)
р-казеин 23994.3
1000 2000 3000 5000 7000
j^L
20000 40000
m/z
6000
10000 15000 20000
Рис. 2. Масс-спектры продуктов гидролиза р-казеина Ьоп-протеиназой в присутствии ATP-Mg (а) и AMP-CPP-Mg (б). Время реакции 30 мин; степень гидролиза субстрата 30 (а) или 10% (б).
шается более чем на порядок (табл. 1). Таким образом, взаимодействие с ATP-Mg не влияет на связывание субстрата в сорбционном участке пеп-тидазного центра, но воздействует на каталитический аппарат Ьоп-протеиназы, активируя расщепление тиоэфирной связи, то есть ATP-Mg проявляет свойства неконкурентного аллостерического активатора пептидазных центров фермента.
Изучение тиоэстеразной. активности Ьоп-протеиназы в присутствии комплекса негидролизуе-мого аналога АТР (АМР-СРР) с магнием позволяет моделировать функционирование пептидазных центров для случая, когда АТР-азные центры фермента находятся в связанном с ATP-Mg состоянии, но гидролиз нуклеотида не происходит. Значения кинетических констант гидролиза Ьоп-протеиназой тиоэфирного субстрата в присутствии AMP-CPP-Mg практически совпадают со значениями, полученными в условиях гидролиза АТР
(табл. 1). В присутствии ADP-Mg пептидазные центры фермента, как и было показано ранее [24], полностью ингибируются (табл. 1 и рис. la, 1). Таким образом, именно связывание ATP-Mg вызывает активацию, а связывание ADP-Mg - ингиби-рование пептидазных центров Ьоп-протеиназы, то есть ATP-Mg проявляет свойства модифицируемого аллостерического эффектора по отношению к пептидазным центрам Ьоп-протеиназы. Аналогичные данные получены при изучении гидролиза мелиттина Ьоп-протеиназой (рис. 1а, 2).
Влияние состояния АТ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.