Ш БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2011, том 37, № 2, с. 199-215
ОБЗОРНАЯ СТАТЬЯ
УДК 577.218
ПРОТЕОМИКА И ПЕПТИДОМИКА В ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПРИКЛАДНЫХ МЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ © 2011 г. В. М. Говорун*, **# , В. Т. Иванов**
*Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства РФ, Россия, Москва; **Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997ГСП, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 03.09.2010 г. Принята к печати 03.09.2010 г.
Обзор посвящен актуальным вопросам биомедицинской протеомики и пептидомики. Уделено большое внимание современным протеомным технологиям, используемым в медицинских исследованиях — методам экстракции, детекции и анализа получаемых данных. Подробно обсуждены способы применения хроматографических, масс-спектрометрических и хроматомасс-спектрометрических методов в протео-геномных и биомедицинских исследованиях и при поисках биомаркеров.
Ключевые слова: протеомика, пептидомика, биомедицинские исследования.
ВВЕДЕНИЕ
Среди постгеномных наук протеомика занимает особое место, поскольку эта дисциплина в основном имеет дело с инвентаризацией и идентификацией участников конечной стадии передачи информации в клетке — белками и пептидами. Несмотря на последние достижения в идентификации белков и пептидов de novo, основой протеогеномной инвентаризации являются аннотированные геномы и продукты трипсинолиза белков, полученные in vitro [1, 2]. За пятнадцать лет существования термина "протеомика" достигнут значительный прогресс как в самих технологиях идентификации белков, их количественного определения, методов стандартизации протеомных исследований, так и в геномных технологиях, которые, без сомнения, служат основой для развития протеомики и пептидомики [2]. Протеомные технологии используются повсеместно: в сельскохозяйственной и промышленной биотехнологии, клеточной инженерии, криминалистике, микробиологии, палеонтологии и других областях естествознания, поэтому осветить в одной обзорной статье все направления исследования, методы и результаты не представляется возможным.
Мы сконцентрировали свое внимание на основном направлении протеомики, имеющем как фундаментальное, так и прикладное значение — биомедицине, так как в последнее время биомедицинские исследования устойчиво вышли на первое место по
Сокращения: MALDI-TOF/TOF — времяпролетная мат-рикс-ассоциированная лазерная десорбция/ионизация; ESI — ионизация распылением в электрическом поле. #Автор для связи (тел.: (499) 246-77-21; эл. почта: govo-run@hotmail.ru).
числу публикаций и объемам финансирования в развитых странах мира. В каком-то смысле протеомика человека, поиск новых белковых и пептидных маркеров различных патологий представляет неотъемлемую часть более общего процесса изучения патогенеза распространенных заболеваний и разработки эффективных методов коррекции пограничных патологических состояний [3]. Не удивительно, что с развитием протеомных технологий и так называемых методов "трансляционной медицины" связывают быстрый переход от медицины вообще к персонификации и профилактике для каждого конкретного индивидуума [4]. В обзоре мы постарались уделить особое внимание ключевым вопросам, которые определяют успех проведения любого биомедицинского исследования, и разобрать современные технологические приемы, используемые в протеомных экспериментах. Кроме этого, в разделе, посвященном примерам использования технологий, мы рассмотрели тенденции объединения про-теомных данных с метаболомными и геномными исследованиями для обеспечения надежной диагностики заболевания на ранних стадиях и выявления новых комбинаций биомаркеров, способных обеспечить раннюю диагностику в онкологии и других областях медицины.
СОВРЕМЕННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ БИОМЕДИЦИНСКОЙ ПРОТЕОМИКИ И ПЕПТИДОМИКИ
Пептидомика в ее современном виде, безусловно, является частью протеомики. Поскольку эта дисциплина имеет аналогичную или идентичную методическую базу, ее можно рассматривать как
Рис. 1. Экспериментальная линейка методов и технологий в протеомике и пептидомике. LC — жидкостная хроматография; ESI-MS/MS — электроспрейная ионизация с тандемной масс-спектрометрией; MALDI-TOF/TOF — матрично-ас-социированная времяпролетная лазерная десорбция/ионизация; LC-MALDI — жидкостная хроматография с последующей матрично-ассоциированной лазерной десорбцией/ионизацией; SELDI — поверхностно-активированная лазерная десорбция/ионизация; SEQUEST — программа анализа данных тандемной масс-спектрометрии; Mascot — программа обработки данных времяпролетной масс-спектрометрии; PCA — компонентный анализ; PLS-DA — статистический метод — дискриминационный анализ наименьших квадратов.
Пептидный образец
Экстракция
Ткань
Плазма/сыворотка Моча
Спинномозговая
жидкость
Слюна
Другие экстракты
Разделение
Ультрафильтрация
Осаждение
органическими
растворами
Твердофазная
экстракция
Хроматографические
методы
с использованием материалов с ограниченным доступом Другие методы
Многомерная белковая идентификация
Обращенно-фазовое разделение SEC
предварительное фракционирование
Другие методы
ESI-MS/MS MALDI-TOF/TOF LC-MALDI
SELDI
фингерпринт
Изотопное разделение
раздел протеомики, анализирующий белки малой массы (<10 кДа), а также весь набор продуктов их протеолитической деградации in vivo и in vitro [5]. Как и белки, пептиды часто имеют достаточно специфичные функции, являясь гормонами, нейроме-диаторами, цитокинами или факторами роста [6]. Некоторые пептиды, являясь продуктами ферментативной деградации белков в организме, часто служат индикаторами нормальных или патологических процессов, что может быть использовано при выявлении новых маркеров ранних стадий заболевания или медиаторов патологического процесса. В каком-то смысле, современные технологии пепти-домики и протеомики направлены на разработку этих новых "полей" с целью нахождения отдельных индикаторных пептидов или белков и их идентификации, а также поиску алгоритмов для выявления и последующего использования эффективных комбинаций различных маркеров бел-ково-пептидной природы для диагностики. В основном пептиды могут возникать следующими способами: деградацией белков протеолитически-ми ферментами внутри- и внеклеточной локализации, а также расщеплением препробелков и непосредственным синтезом.
Биоактивные пептиды играют ключевую роль как медиаторы трансдукции сигнала в респираторной, сердечно-сосудистой, эндокринной, нервной и иммунной системах. Идентификация новых биологически активных пептидов происходит постоянно по мере совершенствования методов их анализа. Фрагменты деградации белков, в том числе "специ-
фических", попадают в различные биологические жидкости организма человека (кровь, моча, ликвор, лимфа) и являются объектом пристального изучения современной пептидной химии [7].
Анализ белков и пептидов (top/down-proteom-юб) условно можно разделить на несколько стадий (рис. 1), каждая из которых имеет ряд существенных ограничений и поэтому часто вызывает трудности при интерпретации результатов.
Технологии включают несколько этапов и состоят из сбора материала (часто существенным является источник получения, длительность и условия хранения и многие другие факторы, оговариваемые заранее), пробоподготовки, разделения сложных многокомпонентных смесей, детекции пептидов, их идентификации (структуры пептидов), количественного анализа [8].
Основные методические отличия протеомики от пептидомики сводятся к тому, что белки перед анализом подвергаются протеолитической деградации эндопептидазами, из которых наиболее часто используется трипсин [1]. Также применяют химот-рипсин и стафилококковую протеиназу, однако они обладают более низкой активностью. В некоторых специальных случаях протеомного анализа применяют бромциановую фрагментацию по остаткам метионина или ее комбинацию с протеолизом. Все дальнейшие стадии происходят аналогично в про-теомике и пептидомике, хотя следует признать, что в случае анализа пептидов эндогенного происхождения возможно получение структуры без предварительной обработки образцов эндопептидазами, —
фрагментацией и точным определением массы материнского иона и продуктов фрагментации в высокоточных масс-детекторах. Точность определения масс и совершенствование методов фрагментации пептидов позволяет в значительном количестве экспериментов получать достоверные сведения о структуре анализируемых пептидов de novo.
При анализе смеси пептидов и белков первый и наиболее важный этап заключается в отделении пептидов от высокомолекулярных соединений, с которыми они находятся во взаимодействии. Обязательным для проведения медицинских исследований является стандартизация методов экстракции, поскольку решение этой проблемы обусловливает получение воспроизводимых результатов. Опубликован ряд экспериментальных статей и обзоров, посвященных методам отделения пептидов от высокомолекулярных белков, разработке и использованию методов десорбции пептидов с высо-копредставленных белков плазмы и сыворотки крови человека и лабораторных животных, однако следует отметить, что, несмотря на разнообразие подходов, на практике, как правило, используются комплементарные технологии, позволяющие добиться идентификации и количественной оценки возможно большего пула пептидов в биологических жидкостях и тканях [9]. Рассмотрим вкратце основные методические приемы, используемые для реализации первого этапа.
Твердофазная экстракция
Твердофазная экстракция используется достаточно давно для пробоподготовки, заключающейся в дополнительной очистке пептидов перед проведением хроматомасс-спектрометрического анализа. Следует отметить, что в настоящее время в медицинских и биомедицинских исследованиях наиболее часто используются магнитные микрочастицы с функционализированной поверхностью, поскольку они позволяют масштабировать процесс пробо-подготовки, увеличивают его производительность, а использование современной робототехники делает процесс пробоподготовки стандартизированным [10]. Использование магнитных ч
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.