ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2015, том 62, № 6, с. 893-905
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ =
УДК 581.1
ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ ЦИКЛОГЕКСИМИДА
НА КОРНИ ГОРОХА © 2015 г. И. А. Тарчевский, А. М. Егорова
Федеральное государственное учреждение науки Казанский институт биохимии и биофизики
Казанского научного центра РАН, Казань Поступила в редакцию 12.03.2015 г.
Проведен протеомный анализ влияния 72-часовой обработки корней проростков гороха (Pisum sativum L., сорт Труженик) 10 мкМ раствором циклогексимида (ЦГ). Обнаружено, что ЦГ вызывал снижение содержания 33 белков. Неожиданным было повышение содержания 29 белков. Возможно, что это впервые установленный факт не только ингибирования, но и активации накопления белков у эукариотических клеток под влиянием ЦГ. Поскольку большая часть идентифицированных ЦГ-индуцированных белков — это ферменты синтеза фитоалексинов и лигнина, то наши исследования позволили выявить новый феномен ЦГ, а именно: накопление ферментов, участвующих в фенилпропаноидном антипатогенном защитном метаболизме. Механизм этого необычного феномена неизвестен и его выяснение является задачей будущих исследований.
Ключевые слова: Pisum sativum — циклогексимид — протеомы — фитоалексины — лигнин
DOI: 10.7868/S0015330315060172
ВВЕДЕНИЕ
При ранее проведенном протеомном анализе влияния салициловой кислоты (СК) на растения мы выявили целый ряд салицилат-зависимых белков [1, 2], содержание которых или повышается, или снижается после обработки корней СК в различных концентрациях как одним из ключевых факторов фитоиммунитета. При этом чаще всего не учитывается, что изменение содержания этих белков зависит как от синтеза, так и от протеолиза. При использовании в качестве субстратов синтеза белков 14С-аминокислот мы показали, что большая часть метки включается в салицилат-индуци-руемые белки [3], что свидетельствовало об основном вкладе в их содержание процессов синтеза, а не ингибирования протеолиза. Другой подход к решению этой задачи — подавление синтеза белков при помощи ингибиторов трансляции. Так как большинство салицилат-индуцируемых белков кодируется ядерными генами и синтезируется рибосомами цитоплазмы, то мы решили выяснить при помощи протеомного анализа, как влияет на содержание белков растений циклогексимид (ЦГ) — ингибитор синтеза белков в 808 рибосомах. Эта за-
Сокращения: ЦГ — циклогексимид; СК — салициловая кислота.
Адрес для корреспонденции: Тарчевский Игорь Анатольевич. 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31. Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН. Факс: (843) 292-73-47; электронная почта: tarchevsky@kibb.knc.ru
дача представлялась актуальной еще и в связи с тем, что по имеющейся у нас информации, до сих пор не проводилось сравнительного анализа про-теомов, основанного на 2Э-электрофоретическом разделении белков, выделенных из органов ин-тактных растительных и животных объектов, обработанных ЦГ.
Имеются лишь данные, полученные при помощи одномерного электрофоретического разделения белков в денатурирующих условиях, указывающие на отсутствие влияния ЦГ на окраску одних белковых полос и ослаблении окраски других полос [4].
В качестве объекта исследований мы использовали корни гороха, так как ранее на них в основном проводили протеомный анализ влияния СК. Кроме того, в корнях отсутствуют хлоропла-сты, протеом которых мог усложнить картину ответа совокупности белков на действие ЦГ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Обработка растений. Семена гороха (Pisum sativum L., сорт Труженик) стерилизовали в течение 20 мин в растворе перманганата калия, после этого промывали дистиллированной водой и проращивали на влажной фильтровальной бумаге в темноте в течение 3 суток. Затем проростки помещали на 5 суток на 1/4 нормы питательной среды Хогланда—Арнона при 25°C и освещении люми-
несцентными лампами при 16-часовом световом периоде. В опытных вариантах корни 8-суточных проростков погружали на 72 ч в среду, содержавшую циклогексимид (ЦГ, 10 мкМ). Контролем служили проростки, растущие на среде Хоглан-да—Арнона. Выбор экспозиции (72 ч) обусловлен тем, что в ходе наших предшествующих опытов с корнями гороха было показано, что при меньших экспозициях недостаточно полно обнаруживается влияние различных соединений на содержание многих белков. Более длительные экспозиции могут привести к побочным эффектам, особенно в случае ЦГ, который, как известно, способен оказывать воздействие (вторичное) на различные физиологически процессы.
При выборе концентрации ингибитора (10 мкМ) мы учитывали полученную ранее информацию о том, что такая концентрация ЦГ вызывала относительно небольшое снижение интенсивности синтеза белков, в то время как более высокие концентрации (40—70 мкМ) приводили к существенному подавлению (на 65—90%) включения меченых аминокислот в белки [4, 5].
Через 3 суток корни отрезали и фиксировали жидким азотом.
Экстракция растворимых белков. Для выделения растворимых белков навески корней весом 1 г растирали в жидком азоте в порошок. Экстракцию растворимых белков проводили с использованием буфера 25 мМ Трис-HCl, pH 8.0, c добавлением 100 мМ ДТТ, 1 мМ ЭДТА, 1% коктейля ингибиторов протеаз при 4°С. Полученный гомогенат центрифугировали 20 мин при 14000 g. Супернатант отбирали и приливали к нему равный объем ледяного раствора 20% ТХУ в ацетоне с добавлением 100 мМ ДТТ Осаждение белков проводили в холодильнике при —20°С, после чего образцы центрифугировали 20 мин при 14000 g. Полученный осадок промывали четыре раза холодным ацетоном с 50 мМ ДТТ, высушивали на воздухе и хранили при —85°С. Для растворения белков использовали буфер, содержавший 6 М мочевины, 2 М тиомочевины, 50 мМ ДТТ, 2% Тритон Х-100, 2% CHAPS, 0.5% Bio-Lyte, pH 3-10 ("Bio-Rad", США). Осадок растворяли при периодическом перемешивании в течение 2 ч, затем раствор центрифугировали 20 мин при 14000 g. Надосадочный раствор собирали и использовали для определения содержания белка.
Количественное определение белка. Пробы объемом 5 мкл разбавляли водой и использовали для определения белка по методике, прилагающейся к коммерческому реактиву Bradford ("BioRad"). В качестве стандарта использовали БСА.
Двумерный электрофорез белков. 20-электро-форез проводили на приборе Protean IEF Cell, Protean II xi 2-D Cell ("Bio-Rad") с использованием стрипов длиной 17 см с линейным градиентом
pH 4-7 ("Bio-Rad"). Для нанесения на стрипы для изоэлектрофокусирования (ИЭФ) белки растворяли в буфере, содержавшем 6 М мочевину, 2 М тиомочевину, 4% CHAPS, 50 мМ ДТТ и 0.5% Bio-Lyte, pH 3-10 ("Bio-Rad") и следы бромфе-нолового синего. Пробы для нанесения на стрипы содержали равное количество белка (550 мкг).
На первом этапе проводили активную регид-ратацию стрипов при 50 В в течение 12 ч. Затем обессоливали образцы при 250 В в течение 15 мин, после чего линейно повышали напряжение до 10000 В за 5 ч, далее проводили собственно ИЭФ до 60000 вольт-часов. Перед началом разделения белков во втором направлении стрипы уравновешивали 15 мин в буфере, содержавшем 0.125 М Трис-HCl, 2% ДДС, 2% ДТТ, 30% глицерин, 6 М мочевину и следы бромфенолового синего, затем выдерживали 15 мин в буфере, который содержал вместо ДТТ 2.5% йодацетамида. Разделение белков по молекулярным массам проводили в 12.5% ДДС-ПАГЭ (40 мА на 1 гель) [6]. Пластины геля окрашивали Кумасси G-250 с 2% ТХУ, что позволяло количественно оценить содержание белков.
Полученные гели сканировали в сканере EPSON 4990 Photo, и изображения гелей обрабатывали при помощи программы PDQuest ("BioRad"). Для анализа использовали по три повтор-ности каждого варианта. Достоверность полученных данных оценивали по i-критерию Стьюдента приp < 0.05. Для идентификации выбирали пятна белков, содержание которых в опытном варианте изменялось в два раза (в большую или меньшую сторону) по сравнению с контролем. Пятна интересующих нас белков вырезали вручную и проводили трипсинолиз.
Трипсинолиз белков и их идентификация. Вырезанные кусочки геля, содержащие белки, промывали водой. Затем их промывали смесью ацето-нитрила с 200 мМ гидрокарбоната аммония в соотношении 1 : 1 при 56°C для удаления краски. После полного обесцвечивания кусочков геля проводили их дегидратацию при помощи 100% ацетонитрила. Надгелевый раствор убирали, и высушивали кусочки геля на воздухе, после чего приливали к ним раствор модифицированного трипсина ("Promega", США) с концентрацией 10 мкг/мл в 50 мМ гидрокарбонате аммония и инкубировали в течение 1 ч при 4°С, чтобы раствор трипсина вошел в гель. Для предотвращения высыхания кусочков гелей при трипсинолизе к пробам добавляли 50 мМ раствор гидрокарбоната аммония. Реакцию трипсинолиза проводили в течение 12 ч при 37°С. Для экстракции пептидов к пробам добавляли смесь ацетонитрила с 5% муравьиной кислотой в соотношении 2 : 1 и выдерживали при перемешивании 1 ч. Надгелевый раствор использовали для идентификации белков.
кДа 102 -
72
48
34
27
17
(а) 4
кДа 102 -
72 -
48 -
34-
0605 \
р1
у™ ро
Чз
14021403 ^ 1
ч
А
12
0223
3201^. 1203 3205-
• У
4301
к 5505 „05
р . --«-6506 ' 09 . ^-5510 • ' V - _ 7405
"•5402 • * * • • ' г
0 ^ <&>5 У 6402 У •
5301 7302
' ^6204
164"
Р1
4907 /
06^
1402 М03 \ 1
13(^6
0223 1203
/ Г
3/05 . „0 / /
4607 ' •
X, , * •
I 5505
Г 5507-^Г .^б5°6 ¿Ы
3409 7405 7422
~*-5402 • \ /
43<^ \64<°
6305 6402 У у
5301 7302
-> \
7
,6204
1
к
27
17 -
/
Л
2004
(б) ^
Рис. 1. Электрофореграммы растворимых белков корней гороха. а — контроль; б — опыт, 10 мкМ ЦГ.
Масс-спектры получали в ESI-Q-TOF масс-спектрометре MicrOTOF-Q ("Bruker Daltonics", Германия) в режиме наноспрея, с предварительным разделением 2 мкл полученной смеси пептидов в хроматографе Ultimate 3000 ("Dionex", Нидерланды). Образец обессоливали на предколон-ке в течение 3 мин в фазе А, которая состояла из 5% ацетонитрила и 95% воды с добавлением 0.1% муравьиной кислоты. Затем образец загружали на основную колонку C18 PepMap 100, 3 мкм, 100 Ä, с внутренним диаметром 75 мкм и длиной 15 см ("Dionex"). Разделение пептидов происходило в градиенте ацетонитрила (фаза В: 5% воды, 95% ацетонитрила с добавлением 0.1% муравьиной
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.