ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 1, с. 5-14
УДК 577.1
ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ ГЕТЕРОХИТООЛИГОСАХАРИДОВ В ОПЫТАХ in vitro (ОБЗОР)
© 2015 г. А. В. Ильина, В. П. Варламов
Центр "Биоинженерия"Российской академии наук, Москва, 117312 e-mail: varlamov@biengi.ac.ru Поступила в редакцию 26.05.2014 г.
В обзоре проанализированы литературные данные за последние десять лет с целью выявления взаимосвязи структуры и состава олигомеров хитина/хитозана с их противоопухолевой активностью in vitro.
DOI: 10.7868/S0555109915010067
Олигосахариды, состоящие из звеньев М-аце-тилглюкозамина и/или глюкозамина, соединенных между собой Р-1,4-О-гликозидной связью, общепринято называть хитоолигосахаридами. Го-мохитоолигосахариды — олигомеры М-ацетил-глюкозамина (АГА) или глюкозамина (ГА). Гете-рохитоолигосахариды — смесь, содержащая различные олигомеры, различающиеся по степени полимеризации (СП), степени ацетилирования (СА), или дезацетилирования (СД), а также по расположению М-ацетильных остатков по длине оли-гомерной цепи. Обычно гетерохитоолигомеры со степенью полимеризации <10 растворимы в воде. Растворимость хитоолигосахаридов со СП > 10 зависит от СА и рН раствора. Фармацевтическая, пищевая отрасль, а также ученые, занимающиеся фундаментальными исследованиями, проявляют интерес к использованию гетерохитоолигосахари-дов. Объясняется это их уникальными свойствами: хорошей растворимостью в воде, минимальной токсичностью, биосовместимостью, способностью проникать через клеточные мембраны, следствием чего является высокая степень всасывания, в отличие от хитина и хитозана и проявляемой ими биологической активностью. Поэтому в последнее десятилетие исследователи сосредоточили внимание на изучении взаимосвязи структуры олигосахари-дов и проявляемой ими специфической активностью — противоопухолевой, антимикробной, анти-оксидантной, иммуномодулирующей и др. Об этом свидетельствует и количество публикаций, возросших в 2 раз по сравнению с 2001 г. [1—4].
ПОЛУЧЕНИЕ ГЕТЕРОХИТООЛИГОСАХАРИДОВ ФЕРМЕНТАТИВНЫМ ГИДРОЛИЗОМ
Хитозановые олигосахариды — олигомеры, которые могут быть получены из хитозана химическим, физическим или ферментативным гидролизом. В последнем случае для получения низкомоле-
кулярного хитозана и олигомеров используются карбогидразы (КФ 3.2.1.х), а именно хитиназы и хи-тозаназы, с последующим применением N-ацетил-глюкозаминдезацетилазы (КФ 3.5.1.41) с целью регулирования степени дезацетилирования.
Ферментативный метод гидролиза хитозана наиболее простой и позволяет осуществлять процесс в мягких, регулируемых условиях. Научный и коммерческий интерес представляют гетерохи-тоолигосахариды с запланированным количеством и нужной последовательностью сахарных остатков. В этой связи активно ведется селекция новых микроорганизмов, продуцирующих высокоактивные карбогидразы специфического действия [4—10].
Хитозаназы в зависимости от их субстратной специфичности, которая определяется физико-химическими характеристиками субстрата, подразделяются на подклассы I, II и III. Все три субкласса хитозаназ гидролизуют связь (ГА—ГА) между двумя дезацетилированными сахарными остатками. Хитозаназы, принадлежащие к субклассам I и III, способны гидролизовать связь между сахарными остатками (АГА—ГА) и связь между (ГА—АГА) соответственно [4]. Например, для деградации хи-тозана с целью получения олигомеров со степенью полимеризации (n = 2—4) Гао с соавт. [5] выделили специфические хитозаназы, продуцируемые Bacillus cereus D-11. Далее в оптимальных условиях проведения гидролиза после дополнительной очистки из 4 г растворимого хитозана ими были получены олигохитозаны: (ГА)2, (ГА)3, и (ГА)4 — 0.95, 1.4 и 1.18 г соответственно.
Группой исследователей из экстракта листьев Capsicum annuum были выделены и очищены с помощью методов хроматографии 3 специфические хитозаназы: А1, А 2 и А3 (ММ 23, 33 и 94 кДа соответственно), которые далее использовались для ферментативного гидролиза хитозана [6]. Причем, хитозаназы А1 и А3 гидролизовали субстрат по эн-до-типу, с получением смеси олигомеров (n = 2—5),
тогда как хитозаназа А2 по экзо-типу с преобладанием глюкозамина. Все три типа изоферментов деполимеризовали хитозан до олигомеров хито-зана. Причем олигосахариды, полученные при действии хитозаназы Аь проявляли наибольшую ингибирующую активность по отношению к линии клеток HEPG2 (гепатоцеллюлярная карцинома печени), а олигомеры, полученные под действием хитозаназы А3, на линии клеток HCT-116 (карцинома толстой кишки). Результаты проведенных опытов показали, что все полученные оли-госахариды проявляли одинаковую цитотоксич-ность в отношении клеток MCF7 (рак молочной железы). К сожалению, исследователи не приводят конкретных результатов по количественному составу смеси олигосахаридов и их СА.
Результаты хроматографического анализа (ВЭЖХ) гидролизата хитозана, полученного с использованием неочищенного экстракта карбогид-раз, продуцируемых грибом Metarhizium anisopliae, показали, что исследователи получили смесь оли-гомеров, состоящую из мономера ГА, тримера (ГА)3, тетрамера (ГА)4 и пентамера (ГА)5 в концентрации 6.532; 0.792; 0.395 и 0.352 (мг/мл) соответственно [7]. Содержание глюкозамина в смеси на порядок выше других олигомеров, что, по мнению авторов, доказывает присутствие в ферментном препарате (сыром экстракте) экзо- и эндо-хитоза-назы. Полученные олигомеры хитозана (смесь) в концентрации 0.1—1 мг/мл проявляли противоопухолевую активность на двух линиях опухолевых клеток HepG2 и HeLa (рак шейки матки). Исследование клеточной пролиферации и цитоток-сичности показало, что олигомеры ингибировали пролиферацию клеток HeLa на 60%. В результате гидролиза хитозана хитиназой В (ChiBeta), выделенной из Serratia marcescens, была получена смесь олигосахаридов со степенью полимеризации от 2 до 20. Состав и количество полученных фракций олигомеров зависел от СА исходных образцов хитозана. Следует отметить, что экспериментально была подобрана модель для гидролиза хитозана хитиназой с целью получения смеси олигомеров с запланированным составом [8].
Набор олигосахаридов, полученных в результате ферментативного гидролиза хитозана с СА 65% и интенсивностью протекания, характеризующейся величиной а = 0.37, исследовали спектральным методом. Полученные данные сравнивали с теоретически рассчитаными. Оказалось, что результаты хорошо согласовывались только для димеров АГА—АГА и ГА—АГА, а для тримеров и тетрамеров различались в несколько раз. В дальнейшем исследователи воспользовались более современным методом, позволяющим выбрать оптимальные параметры по СА субстрата и глубине протекания гидролиза (величина а). Результаты, представленные на рис. 1, показывают,
как изменяется количество различных олигомеров в зависимости от величины а (ось Х) и СА хитозана (ось Y). Полученный профиль позволил исследователям выбрать оптимальное время и скорость проведения гидролиза, а также параметры субстрата для ферментативной реакции и получить запланированные олигомеры. Например, ок-тамер может быть получен с высоким выходом (8% от общей массы биополимера — красный цвет на изображении) из хитозана с СА 0.4 и при величине а = 0.18.
В исследованиях, проводимых Шеном с соавт., источником для получения олигосахаридов служил хитозан, который выделяли из грибов [9]. Для гидролиза использовали протеиназу бромелаин (КФ 3.4.22.х). Были получены олигосахариды со степенью полимеризации от 3 до 8. Из анализа результатов, полученных с помощью ВЭЖХ, следовало, что в смеси в количественном отношении преобладает пентамер, в то время как димер и тет-рамер присутствовали в равных количествах, гек-самера, гептамера и октамера было на порядок меньше по сравнению с пентамером. Смесь полученных олигохитозанов была изучена на противоопухолевую активность in vitro на линии клеток HepG2. Были предприняты попытки исследовать механизм ингибирования пролиферации клеток, в результате отмечено снижение количества репли-цированной ДНК (S-фаза). В опытах in vivo на мышах 6—8-недельного возраста с использованием модели метастазирования карциномы в легких (Lewis lung carcinoma metastasis model) по результатам микроскопии было зафиксировано, что объем опухоли на 16, 19, 22 и 26 сут при дозе введения 100 мг/кг (парентерально) постепенно уменьшался. При введении 500 мг/кг ежедневно в течение 28 сут он снизился в конце опыта на 80% (рис. 2).
Полученные результаты представляют несомненный интерес, однако используемую смесь олигохитозанов исследователи не охарактеризовали по степени ацетилирования, расположению ацетильных остатков по цепи, что затрудняет сравнение с результатами, которые получают в других лабораториях.
Только в случае специфических карбогидраз при гидролизе можно получать олигомеры с запланированными физико-химическими характеристиками, а при использовании ферментных препаратов и гидролаз неспецифического действия продуктами реакции являются олигомеры хитина/хитозана, которые необходимо характеризовать полностью, по всем значимым параметрам.
ДЕЙСТВИЕ ГЕТЕРОХИТООЛИГОСАХАРИДОВ НА РАЗЛИЧНЫЕ ТИПЫ КЛЕТОК
В связи с проявляемой гетерохитоолигосаха-ридами специфической активностью, в том числе
Рис. 2. Антиметастазирующая активность олигосахаридов in vivo. Морфологические изменения в легких у мышей с перевитой карциномой Льюиса (ЛКЛ) [9].
а — контроль; б — метастазированное легкое; в — после введения хитолигосахаридов (ХОС) со СП n = 3—8.
(а)
<v
и противоопухолевой, в настоящее время активно изучается их воздействие на различные типы клеток, например на макрофаги, остеобласты, фиб-робласты, клетки эндотелия, эритроциты и др. Было показано, что проявляемый эффект зависит от клетки мишени, физико-химических характеристик олигомера и используемой концентрации.
В исследованиях Фенга с соавт. [10] было установлено, что олигохитозан с СП 4—6 и СА 15%, полученный в результате ферментативного гидролиза, в опытах in vivo оказывал стимулирующий эффект на макрофаги, который оценивали по появлению фактора некроза опухоли (TNF-a), ин-терлейкина (IL-1P). С помощью конфокальной микроскопии визуализир
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.