МИКРОБИОЛОГИЯ, 2009, том 78, № 5, с. 641-646
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 541.123:54621;546831;546832
ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИПИДНОЙ ФРАКЦИИ СПОР АНАЭРОБНОЙ БАКТЕРИИ CLOSTRIDIUM BUTYRICUM
© 2009 г. Г. П. Гаенко*' Е. В. Моисеева*, О. Ю. Савельев**, Ю. Г. Молотковский*, Е. Л. Водовозова*
*Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва **Центр магнитной томографии и спектроскопии, Московский государственный университет
им. М.В. Ломоносова Поступила в редакцию 04.11.2008 г.
Установлена противоопухолевая активность препарата липидной фракции экстракта спор Clostridium bu-tyricum на перевиваемой мышиной модели рака молочной железы in vivo. При определенной схеме введения препарата выявлено торможение роста опухоли и улучшение динамики выживания животных опытной группы по сравнению с животными контрольной группы. С помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) в составе липидной фракции экстракта спор был выявлен, помимо предельного углеводорода, эфира холестерина, цетилпальмитата, триацилглицерина и пальмитиновой кислоты, также фе-нольный липид в комплексе с пептидным компонентом. Из липидного пула путем экстракции ацетоном выделен фенольный липид. На основании данных ТСХ и 1Н-ЯМР-спектра ацетонового экстракта липидной фракции спор C. butyricum для фенольного липида предложена структура - н-бутилового эфира бензойной кислоты, содержащего заместитель в пара-положении. Предполагается, что именно фенольный липид является фактором биологической активности липидной фракции спор.
Ключевые слова: резорцинольные липиды, липидная фракция спор бактерий, противоопухолевая активность.
Известно, что в процессе образования покоящихся форм бактерий метаболизм вегетативных клеток изменяется. Установлено, что бактериальные цисты содержат в два раза больше липидов, чем вегетативные клетки [1]. Уже по одной этой причине липиды анабиотических форм вызывают интерес. Отмечается, что при образовании покоящихся форм резко возрастает содержание феноль-ных липидов: так, 5-алкилрезорцинолы и 6-алкил-пироны замещают фосфолипиды в цитоплазмати-ческой мембране клеток Azotobacter vinelandii в процессе инцистирования [2].
Липиды амфифильной природы, имеющие в своей структуре бензольное кольцо - фенольные липиды, резорцинольные липиды - обладают разнообразной биологической активностью. Универсальность их свойств связана с влиянием на скорость перекисного окисления липидов, состав и текучесть клеточной мембраны [3, 4].
Литературные данные свидетельствуют о том, что фенольные липиды обусловливают торможение обменных процессов в бактериальных клетках, инициируют образование анабиотических форм [5-7]. Торможение обменных процессов - один из способов повышения общей резистентности организма
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: gpg008@mail.ru).
при различных патологиях, в том числе, и канцерогенезе.
Исследования противоопухолевого действия фе-нольных липидов, выделенных из различных природных источников, выявили высокую активность некоторых из них. Так, фенольный липид билобол (5-н-пентадец-8-енилрезорцин), выделенный из Ginkgo biloba, полностью подавлял рост клеток саркомы мышей S180 в течение 4 сут. применения [8]. Подобная активность наблюдалась и у алкилрезор-цинов (гравилол и 5-н-тридецилрезорциновая кислота) из лекарственного растения Lysimachia japonica против клеток лейкемии P-388, меланомы В-16, карциномы Нер-2 и др. [3]. Резорцинольные липиды привлекают к себе интерес в связи с низкой токсичностью для высших животных. Например, доза 5 г/кг веса per os абсолютно не токсична для крыс [3].
Наряду с противоопухолевой активностью резорцины бактериального и растительного происхождения демонстрируют бактериостатическую активность. Выраженным антибактериальными свойствами обладают фенольные липиды с алкильным заместителем в 4 положении углерода бензольного кольца: выявлена бактериостатическая активность 4-гексилрезорцина против 7 видов фитопатогенных бактерий [3].
Ранее показано, что липидная фракция экстрактов спор C. butyricum оказывает радиотерапевтиче-
ское действие на лабораторных животных при летальных дозах облучения, повышая выживаемость крыс на 37% по сравнению с контролем [9]. Обнаружено, что экстракты спор обладают бактериостати-ческим действием на вегетативные клетки культуры-продуцента, причем, если исходный препарат экстракта спор ингибирует автолиз клеточных стенок бактерий-продуцентов на 30%, то липидная фракция препарата - на 87% [10]. Мы полагаем, что подавление активности клеточных автолизинов может быть опосредовано мембранотропным действием фенольного липида. Влияя на активность мем-браносвязанных ферментов, например, протеаз, регулирующих клеточное деление, фенольные липиды могут подавлять рост новообразований.
Целью настоящей работы являлось изучение противоопухолевого действия липидной фракции спор C. butyricum, содержащей, как было ранее нами показано [10], в своем составе фенольный липид.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Бактериальная культура Clostridium butyricum 35/11 была получена из отдела физиологии спорооб-разующих бактерий Института микробиологии РАН. Споры анаэробных бактерий C. butyricum получали по методу [11]. Способ получения экстрактов спор описан ранее [12]. Липиды выделяли из экстрактов смесью хлороформа с метанолом, согласно общепринятой методике [13, 14], и высушивали в вакууме. Для выделения фенольного липида из липидной фракции спор использовали метод экстракции ацетоном, который позволяет избежать экстракции других липидов [15]. К высушенной фракции липи-дов спор (10-15 мг) прибавляли 2-3 мл ацетона и выдерживали при комнатной температуре на качалке 10-12 ч. Смесь центрифугировали (600 g, 20 мин), су-пернатант отделяли от осадка и упаривали в вакууме. Высушенный остаток растворяли в смеси хлороформ-метанол, 2 : 1 и использовали для дальнейших исследований. ТСХ проводили на пластинках Kieselgel 60 F254 ("Merck"), обнаружение осуществляли фосфорномолибденовой кислотой, нингидрином и реагентом Fast Blue B Sаlt ("Serva").
Спектры ХН-ЯМР регистрировали на спектрометре Bruker Avance-600 (США) при 22°C в смеси хлороформ-di-метанол-d^, 2 : 1, с рабочей частотой 600 МГц, датчик 5 мм, используя сигналы остаточных протонов метильной группы метанола (3.30 м.д.) в качестве внутреннего стандарта. Малое количество вещества потребовало накопления сигналов с числом сканов примерно 1000. Обработка спектров осуществлялась программой XWinNmr 3.1. Двумерные спектры корреляции (COSY) регистрировали в представлении абсолютных значений. Спектральное окно располагали от -0.57 до 8.89 м.д. (регистрировали также спектры с меньшим размером окна для лучшего разрешения сигналов), размерность матрицы данных составляла 16384 х 480,
соответственно, вдоль размерностей F2 и F1. Длительность регистрации составляла 1.44 с, релаксационная задержка 2.6 с, число сканов на один fid примерно 64. При преобразовании данные умножались на взвешивающую функцию типа несмещенный синус-колокол (unshifted sinebell).
Препарат липидной фракции спор C. butyricum готовили по описанному ранее методу [10]. Для исследования противоопухолевой активности этого препарата использовали перевиваемую мышиную модель рака молочной железы CBRB-Rb (8.17) 1Iem (далее CBRB) [16]. В эксперименте использовали 3 группы самцов мышей CBRB в возрасте 4.5 месяцев, по 10 животных в каждой группе. Реципиентам перевивали по 106 опухолевых клеток, полученных из медленно растущей спонтанной аденокарциномы молочной железы сингенной самки по разработанной ранее методике [17].
Препарат (2 мг/мл физиологического раствора; стерилизовали с помощью мембранных фильтров 0.2 мкм) вводили внутрибрюшинно по 0.2 мл на мышь на инъекцию. Животным контрольной группы (группа 3) вводили физиологический раствор в том же объеме. Мыши были поделены на 3 группы, с разными схемами введения препарата относительно времени перевивки опухоли: первой группе животных препарат вводили за 5 сут и за 1 сут до перевивки опухоли; второй группе - препарат дополнительно вводили через час, через 2 сут и через 5 сут после введения опухолевых клеток.
Противоопухолевую активность препарата оценивали по замедлению роста опухолей и улучшению динамики выживания реципиентов по сравнению с контролем в течение 16 недель. Рост опухоли оценивали раз в неделю по изменению среднего диаметра опухоли, вычисляемого по трем взаимноперпенди-кулярным размерам, по разработанной ранее методике [17]. Первые стадии роста опухоли до ее видимого проявления (в течение латентного периода, до 5 мм в диаметре) определяли путем пальпации; достоверность различий определяли по параметрическому критерию Вилкоксона-Манна-Уитни [16].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для тестирования противоопухолевого эффекта липидной фракции спор (на модели рака молочной железы мышей линии CBRB) животных делили на группы в соответствии с разными схемами введения препарата относительно времени перевивки опухолевых клеток. Динамика роста опухоли у животных в различных экспериментальных группах представлена на рис. 1.
У животных 1 группы, обработанных препаратом только 2 раза до перевивки, наблюдалась достоверная стимуляция роста опухоли по сравнению с контролем (с 4 по 8 неделю, p < 0.01). Латентный пальпируемый период роста опухоли в этой группе
Рис. 1. Динамика роста опухоли (мм) у мышей в разных экспериментальных группах: группа 1 - введение препарата за 5 и 1 сут до перевивки опухолевых клеток; группа 2 - введение препарата за 5 и 1 сут до перевивки опухолевых клеток, через 1 ч, 2 сут и 5 сут после перевивки опухолевых клеток; группа 3 - контроль.
сокращен, а скорость роста опухоли возросла (по сравнению со значениями соответствующих параметров в контроле). Динамика выживания животных этой группы была достоверно ухудшена по сравнению с выживанием контрольных мышей (рис. 2).
Во 2 группе животных, где инъекции препарата проводились и после перевивки опухоли, наблюдалось подавление роста опухоли (с 5 по 6 неделю, p < 0.05). Интересно отметить, что последний раз обработку опухолей проводили в первые дни после
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.