МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 5, с. 777-784
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 57.054
ПРОТИВООПУХОЛЕВОЕ ДЕЙСТВИЕ ИНТЕРФЕРОНА mIFN-13 НА ОПУХОЛЬ ПАПИЛОМАВИРУСНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ У МЫШЕЙ ЛИНИИ C57BL/6# © 2015 г. H. Choobin, T. Bamdad*, H. Soleimanjahi, H. Razavinikoo
Department of Virology, Faculty of Medical Science, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
Поступила в редакцию 05.11.2014 г.
Принята в печать 17.12.2014 г.
Связь вируса папилломы человека (ВПЧ) с возникновением рака шейки матки установлена несколько лет назад, но лекарственного препарата против ВПЧ пока нет. Иммунотерапия интерфероном-альфа (IFN-a) — один из перспективных методов воздействия на злокачественную опухоль, несмотря на данные клинических испытаний о множестве побочных эффектов, провоцируемых интерферонотерапией. Недавно обнаружен новый тип интерферона, интерферон-лямбда (IFN-X), применение которого ассоциировано с меньшим числом побочных эффектов, чем при использовании IFN-a. Это обусловлено ограниченным диапазоном рецепторов, связываемых IFN-X. Показано, что IFN-X проявляет как противовирусную, так и противоопухолевую активность, а также ингибирует пролиферацию клеток. Нами исследовано воздействие IFN-a и IFN-X на экспериментальную опухоль папилломавирусного происхождения TC1 на мышиной модели. Клетки TC1 вводили мышам C57BL/6 подкожно. После формирования опухоли в нее вводили экспрессионные конструкции, которые содержали последовательность, кодирующую мышиный интерферон, mIFN-a или/и mIFN-X (по отдельности или в комбинации друг с другом). Продолжительность жизни мышей и размер опухоли, а также процесс апоптоза в опухолях и токсичность клеток-киллеров измеряли трижды после инъекции плазмид. Получены интересные результаты по всем измеренным параметрам, особенно в группе, инъецированной комбинацией mIFN-a и mIFN-X, в сравнению с контрольной группой. На основании полученных результатов можно предполагать, что использование IFN-X, особенно в комбинации с IFN-a, может дать начало эффективному походу к иммунотерапии рака шейки матки папиллавирусной природы.
Ключевые слова: интерферон-альфа, интерферон-лямбда, иммунотерапия, опухоль папилломавирусно-го происхождения.
ANTITUMOR EFFECT OF mIFN-X3 IN C57BL/6 MICE MODEL FOR PAPILLOMA TUMORS, by H. Choobin, T. Bamdad*, H. Soleimanjahi, H. Razavinikoo (Department of Virology, Faculty of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran; *e-mail: bamdad_t@modares.ac.ir). Although several years have passed since the determination of the human papilloma virus (HPV) as the causative agent for cervical cancer, a definitive treatment has not yet been found. Interferon- alpha (IFN-a) immunotherapy is one of the promising methods for tumor treatment, although numerous side effects were observed in clinical trials. Recently, a new type of interferon, lambda-interferon (IFN-X), has been discovered with fewer side effects than IFN-a since its receptor repertoire is limited. IFN-X has a series of activities including antiviral, anti-proliferative and anti-tumor actions. In the present study, the effects of IFN-a and IFN-X on the TC1 papilloma tumor model in C57BL/6 mice were evaluated. TC1 cells were injected into the mice subcutaneously. Upon tumor formation, murine IFN, mIFN-X and mIFN-a, expression plasmids were injected intratumorally in combination or alone. The survival time and tumor size as well as apoptosis in tumors and NK cytoxicity were measured after three injections. As compared with the control group, the remarkable results especially in the group which received mIFN-a and mIFN-X together were obtained for all of the measured parameters. Although IFN-X is a new member of the interferon family and its properties should be studied in detail, the data obtained suggests that the use of IFN-X especially in combination with IFN-a could be considered as an effective strategy for pap-illoma cervical cancer immunotherapy.
Keywords: interfron-alfa, interferon-lambda, immunotherapy, papilloma tumor. DOI: 10.7868/S0026898415050067
# Текст представлен автором на английском языке.
* Эл. почта: bamdad_t@modares.ac.ir
Рак шейки матки (РШМ) — второй по распространенности вид злокачественных заболеваний человека и одна из наиболее значимых причин смерти среди женщин [1]. Несмотря на многочисленные исследования РШМ, его терапия остается неразрешимой проблемой, особенно в развивающихся странах [2]. Вирус папилломы человека (ВПЧ) — одна из основных причин возникновения РШМ. Более 150 биотипов ВПЧ подразделяют на генотипы низкого, среднего и высокого риска — в соответствии с вероятностью онкогене-за [3—5]. Значительная доля больных РШМ умирает, несмотря на применение традиционных методик, таких как криохирургия, радио- и химиотерапия [6]. Необходимы новые терапевтические подходы [7, 8]. Исследовано действие нескольких противовирусных и иммуномодулирующих препаратов на лечение РШМ папилломного происхождения [9]. Современные молекулярно-биоло-гические подходы к онкотерапии основаны на возможности задействовать иммунную систему пациента для воздействия на опухоль. Сейчас для стимуляции иммунной системы больного используют интерфероны как дополнение к курсу химиотерапии. Биологические функции интер-феронов: усиление иммунного ответа путем активации естественных киллеров (NK-клеток) и дендритных клеток, противодействие ангиогене-зу, проапоптотическое действие — позволяют рассматривать их в качестве кандидатов для использования в противораковой терапии [10—12].
С одной стороны, показано, что белок Е7 ВПЧ-16 индуцирует чувствительность злокачественных клеток к IFN-a-зависимому апоптозу. С другой стороны, некоторые виды интерферо-нов, такие как IFN-a, IFN-P и IFN-y, подавляют транскрипцию генов E6 и E7 в некоторых клеточных линиях карциномы [13]. Регуляторный эффект интерферонов на опухолевые клетки папил-ломного происхождения позволяет рассматривать их в качестве кандидатов для терапии ВПЧ-ассоциированных опухолей [14]. В медицинской практике наиболее часто используют IFN-a, но провоцируемые им побочные эффекты, а именно: расстройства нервной системы, подавление кроветворной функции костного мозга, а также гриппоподобная симптоматика с повышением температуры тела, мышечными болями, слабостью, потерей аппетита, рвотой и диареей — ограничивают его применение [10]. В течение последних лет при анализе последовательностей генома человека обнаружена группа интерферонов, получивших название "тип III", или лямбда-интерфе-роны (IFN-^). Эти интерфероны классифицированы как член семейства цитокинов типа II [15, 16]. IFN-^ проявляет противовирусные и противоопухолевые свойства [17—23]. Sato и др. [21] выявили противоопухолевый эффект IFN-^ на ме-ланоме B16 мыши и на опухолях прямой кишки
Colon26. Ими показано, что для подавления роста опухоли при помощи IFN-^ in vivo необходимы NK-клетки. Избыточная экспрессия IFN-^ в клетках B16 индуцирует экспрессию MHC класса I и Fas (CD95), заметно повышает активность кас-пазы-3 и каспазы-7 одновременно с арестом клеточного цикла и апоптозом. IFN-^ задействован в системе клеточных сигнальных путей, похожей на IFN-a [24—26]. По сравнению с IFN-a репертуар рецепторов семейства IFN-^ сужен и число вызываемых им побочных эффектов меньше. Именно поэтому белки IFN-^ считаются перспективными агентами для противораковой терапии [10, 26—28]. Нами проведено сравнение противоопухолевого действия IFN-^3 и IFN-a на мышиной модели опухоли папилломавирусного происхождения.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Плазмидные векторы. Эукариотический экс-прессионный вектор, содержащий последовательность, кодирующую мышиный IFN-^3 (mIFN-^3), предоставлен доктором Sergio Koten-ko [27], а экспрессионный вектор с последовательностью гена мышиного IFN-a1 (mIFN-a1) предоставлен доктором Stefano Indraccolo [29]. Экспрессия обоих интерферонов в эукариотиче-ских клетках подтверждена соответствующими группами исследователей. Для подтверждения структуры вектор pCMV-mIFN-a1 обрабатывали рестриктазами XbaI и BamHI, а вектор pEF-mIFN-^3 рестриктазами EcoRI и KpnI. Предназначенные для инъекции мышам плазмидные векторы выделяли с использованием набора для очистки плазмидной ДНК ("Intron Biotechnology", Корея).
Клеточные культуры. Для получения опухоли в мышиной модели использована клеточная линия TC1, в которой экспрессируются онкобелки Е6 и Е7 ВПЧ-16 [30, 31]. Клетки TC1 культивировали на среде DMEM с 5%-ной фетальной сывороткой крупного рогатого скота. В каждый культураль-ный флакон высаживали по 5 х 106 клеток TC1, по 1 х 106 клеток третьего пассажа инъецировали в каждую мышь.
Клеточную линию миелолейкоза человека K562 культивировали на среде RPMI-1600 и использовали в качестве клеток-мишеней при анализе цитотоксичности NK-клеток.
Работа с животными. Самки мышей линии C57BL/6 в возрасте пяти недель куплены в Иранском институте Пастера (Pasteur Institute of Iran). Мыши содержались в лаборатории в течение одной недели до начала эксперимента в стандартных условиях. Все эксперименты с животными проводили в соответствии с правилами Комитета по содержанию и использованию лабораторных
животных Университета Тарбиат Модарес (Animal Care and Use Protocol of Tarbiat Modares University). Образование опухоли индуцировали путем инъекции 1 х 106 клеток TC1 в левый или правый бок каждой мыши. Через две недели после инъекции, когда размер опухоли достигал 5 мм, животным, распределенным по группам случайным образом (по пять животных в каждой), делали по 3 внутрибрюшинных инъекции с интервалом в 14 сут. В таблице приведено детальное описание этого эксперимента. Вес мышей и размер опухолей фиксировали на каждом этапе эксперимента.
Анализ цитотоксичности NK-клеток. Цитоток-сичность NK-клеток экспериментальных животных проанализирована с использованием клеточной линии K562 — высокочувствительной мишени NK-клеток [32].
Через 14 сут после последней инъекции селезенку мышей извлекали по асептической методике. Селезенку гомогенизировали в полной среде RPMI-1600. Выживаемость спленоцитов определяли по окрашиванию трипановым синим
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.