НЕЙРОХИМИЯ, 2014, том 31, № 4, с. 335-340
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.82
ПРОТИВОСУДОРОЖНОЕ ДЕЙСТВИЕ АНТАГОНИСТОВ КМБА И КАЛЬЦИЙ-ПРОНИЦАЕМЫХ АМРА-РЕЦЕПТОРОВ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ МОДЕЛИ МАКСИМАЛЬНОГО ЭЛЕКТРОШОКА У КРЫС
© 2014 г. А. В. Зайцев1, *, К. Х. Ким1, Е. В. Фролова1, В. В. Лаврентьева1, Н. Я. Лукомская1, Л. Г. Магазаник1,2
Институт эволюционной физиологии и биохимии им И.М. Сеченова РАН 2Санкт-Петербургский государственный университет, медицинский факультет
Известно, что активация ионотропных глутаматных рецепторов играет ведущую роль в инициации судорог и их распространении, однако вклад одного из подтипов, кальций-проницаемых АМРА-ре-цепторов (Са-АМРАЯ), в реализацию судорожных состояний практически не изучен. Противосу-дорожное действие двух каналоблокаторов Са-АМРАЯ, ИЭМ-1754 и ИЭМ-1925, а также комбинации ИЭМ-1925 с каналоблокатором ММБА-рецепторов ИЭМ-1921 исследовалось на крысах породы Вистар, используя модель максимального электрошока. Показано, что оба каналоблокатора Са-АМРАЯ не способны предотвратить развитие генерализованных тонических судорог, вызванных электрошоком. Комбинирование блокатора ММБА-рецепторов ИЭМ-1921 с блокатором Са-АМРАЯ ИЭМ-1925 не привело к усилению противосудорожного действия, наблюдаемого при действии одного ИЭМ-1921. Полученные результаты свидетельствуют о слабой вовлеченности Са-АМРАЯ в реализацию тонических судорог, вызванных максимальным электрошоком.
Ключевые слова: эпилепсия, модель максимального электрошока, антагонисты АМРА-рецепторов, глу-таматные рецепторы.
DOI: 10.7868/S102781331404013X
ВВЕДЕНИЕ
Общепризнано, что ведущую роль в инициации судорог и их распространении играет гиперактивация возбуждающих глутаматных синапсов, при этом особо отмечается вклад постсинаптических ионотропных глутаматных рецепторов NMDA- и AMPA-типов [1, 2]. Этим объясняется эффективность блокаторов NMDA- и AMPA-рецепторов в качестве противосудорожных агентов как в экспериментах in vitro, так и in vivo [3—5]. NMDA-антагонисты с различным молекулярным механизмом действия (каналоблокаторы, неконкурентные и конкурентные антагонисты) позволяют предотвратить возникновение судорог при использовании разных моделей: электрошока [6, 7], широкого набора хемоконвульсантов [8—10], линейных крыс, генетически предрасположенных к судорогам [11].
Антагонисты AMPA-рецепторов обладают более широким спектром противосудорожной активности по сравнению с NMDA-антагонистами,
*Адресат для корреспонденции: 194223, Санкт-Петербург, пр. Тореза, 44, тел.: +7 (812) 552-3138, e-mail: aleksey_zaitsev@mail.ru.
например, они более эффективны при киндлин-ге, чем при острых судорожных припадках [3]. В большинстве моделей эпилепсии оказываются эффективными как конкурентные, так и неконкурентные антагонисты АМРА-рецепторов. Однако неконкурентные антагонисты имеют преимущество, поскольку их действие не ослабляется избыточной секрецией глутамата в возбуждающих синапсах [12]. Противосудорожная активность особой группы неконкурентных антагонистов АМРА-рецепторов — веществ, обеспечивающих блокаду открытого канала только одного из подтипов АМРА-рецепторов, проницаемых для ионов Са2+ (Са-АМРАЯ) до сих пор малоизучена, а полученные данные остаются противоречивыми. Например, выраженный противосудорожный эффект каналоблокаторов АМРА-рецепторов этого типа ИЭМ-1925 и ИЭМ-1754 был показан на моделях эпилепсии, вызванных внутрижелуд очковым введением агониста АМРА-рецепторов каината [13]. При пентилентетразоловой модели эпилепсии максимальный защитный эффект при тонических судорогах наблюдался либо при очень малых дозах этих препаратов 0.1—1 нмоль/кг, либо
Рис. 1. Фотография крысы с тонической экстензией задних конечностей.
при достаточно больших (>10 мкмоль/кг для ИЭМ-1925), однако при любых концентрациях эти препараты были неэффективны против кло-нических судорог [13]. Эти же блокаторы были неэффективны для предотвращения аудиогенных судорог у крыс линии Крушинского—Молодки-ной [11]. В части работ было выявлено, что комбинация антагонистов ММЭА- и АМРА-рецепто-ров дает более выраженный противосудорожный эффект при использовании существенно меньших доз препаратов [11, 14, 15], однако результаты совместного использования каналоблокато-ров ММЭА- и АМРА-рецепторов до сих пор фрагментарны. Поэтому целью данной работы стало исследование предполагаемых противосудорожных эффектов блокады Са-АМРАЯ, а также комбинации блокады Са-АМРАЯ с блокадой ММЭАЯ. С этой целью оценивалась эффективность действия ИЭМ-1925 при совместном применении с кана-лоблокатором ММЭА-рецепторов ИЭМ-1921. Исследования велись на модели максимального электрошока (МЭШ-тест), которая ранее для этой цели не применялась.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты выполнялись на самцах крыс породы Вистар в возрасте 6 нед, средняя масса животных составила 97 ± 3 г, всего в эксперименте было использовано 105 животных. Крыс содержали в виварии при свободном доступе к пище и воде. Для стандартизации условий проведения эксперимента и снижения разброса результатов все опыты проводили в одно и то же время суток с 11 до 14 ч дня. Судороги вызывались максимальным электрошоком (МЭШ-тест) с помощью специализированного стимулятора ECT UNIT 57800 (Ugo Basile, Италия), ток подавался через ушные электроды, применялись следующие параметры стимуляции: сила тока 80 мА, длительность одиночного импульса 0.8 мс, частота импульсов — 100 Гц, длительность стимуляции 0.8 с. Эксперимент проводился в два этапа. В первый день у животных определяли тип реакции на электрошок, животных, у которых в ответ на стандартную стимуляцию не наблюдалось полной экстензии задних конечностей, отбраковывали (ме-
нее 3% животных). На другой день тестировали противосудорожное действие неконкурентных каналоблокаторов Са-AMPAR типа: ИЭМ-1754 [16], каналоблокатора, действующего как на Са-AMPAR, так и NMDAR, ИЭМ-1925 [17], избирательного каналоблокатора рецепторов NMDAR: ИЭМ-1921 [18, 19], а также совместное действие ИЭМ-1921 и ИЭМ-1925. Препараты разводили в физиологическом растворе в день эксперимента, подбирая концентрацию таким образом, чтобы вводимый объем раствора составлял 2 мл на 1 кг веса животного и вводили внутримышечно за 30 мин до электрошока. Тестировался эффект нескольких доз каждого блокатора на группе из 8— 10 животных. Регистрировали силу судорожного припадка, латентный период до достижения полной экстензии задних конечностей (рис. 1) и продолжительность экстензии, также вычисляли коэффициент экстензии, численно равный отношению продолжительности экстензии к ее латентному периоду. Животные, у которых не наблюдалось полной экстензии конечностей, считались защищенными. У защищенных от тонических судорог животных проявлялись либо кратковременные клонические судороги, как правило, без потери позы, либо дикий бег. Данные показатели усредняли по группам, вычислялся процент защищенных животных, сравнение средних значений производили с помощью теста Стьюдента. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Все тестируемые в данной работе блокаторы были синтезированы и любезно предоставлены В.Е. Гмиро (НИИ экспериментальной медицины РАМН).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В контрольных условиях электростимуляция через ушные электроды вызывала полную экстензию задних конечностей (рис. 1) у 97% крыс с латентным периодом 3.2 ± 0.1 мс и длительностью 7.8 ± 0.2 мс, средний коэффициент экстензии составил 2.7 ± 0.1 (n = 102).
Предварительное введение крысам в диапазоне доз 0.1; 1; 3.3 или 10 мг/кг каналоблокатора ИЭМ-1925, у которого выявлена в опытах in vitro способность блокировать как Са-AMPAR, так и NMDA-рецепторы, либо введение ИЭМ-1754, селективного каналоблокатора Са-AMPAR в дозах 1 или 10 мг/кг не защитило животных от появления интенсивных тонических судорог (рис. 2а), латентный период и длительность экстензии задних конечностей так же не уменьшились, более того в группе крыс, которым был введен ИЭМ-1925 в дозе 10 мг/кг, наблюдалась тенденция к увеличению коэффициента экстензии с 3.1 ± 0.5 до 4.5 ± 0.6 (p = 0.054, n = 8, парный t-тест для связанных выборок). Таким образом, ни один из протестированных каналоблокаторов не был способен
ПРОТИВОСУДОРОЖНОЕ ДЕЙСТВИЕ АНТАГОНИСТОВ ММБА
337
Процент защищенных 100
80
60
40
20
0 .
-Ш_I_I_I_I I I I I I
0.1
ИЭМ-1925 ИЭМ-1754
_1_I_I I I I I I
10
Процент животных 100
75
50
Тонические Дикий бег Клонические
25
0.10 0.33 1 10 Доза ИЭМ-1925, мг/кг
100 80 60 40 20 0
100 80 60 40 20 0
ИЭМ-1921
0.1
-Ш_I_I_I_I I I I 11_I_I_I_I I I 111
10
ИЭМ-1921(3.3) + ИЭМ-1925
_|_и_I_I_I_I I I I 11_I_I_I_I I I I 11
0.1
1 10 Доза, мг/кг
Рис. 2. Превентивный эффект каналоблокаторов Са-проницаемых рецепторов АМРА-типа ИЭМ-1754 и ИЭМ-1925 (а), каналоблокатора рецепторов КМВА-типа ИЭМ-1921 (б) и комбинации ИЭМ-1921 и ИЭМ-1925 (в) в зависимости от дозы.
предотвратить развитие генерализованных тонических судорог, вызванных электрической стимуляцией.
Селективный каналоблокатор ММЭА-рецеп-торов ИЭМ-1921 вызывал выраженный дозозави-симый противосудорожный эффект (рис. 2б). Дозы препарата 0.33 и 1 мг/кг не обеспечивали животным защиты, хотя и несколько уменьшали длительность тонической экстензии задних ко-
Рис. 3. Распределение животных по типам судорожного ответа при совместном введении постоянной дозы ИЭМ-1921 (3.3 мг/кг) и различных доз ИЭМ-1925.
нечностей (8.9 ± 0.4 с в контроле, до 7.9 ± 0.3 с при введении ИЭМ-1921, п = 18, р < 0.05, парный ¿-тест для связанных выборок). При введении 3.3 мг/кг ИЭМ-1921 защищенными от генерализованных тонических судорог оказались 15 из 19 животных, а доза 10 мг/кг обеспечивала 100%-ную защиту. Согласно полученным данным, ЕЭ50 составила около 2 мг/кг.
Ранее было выявлено, что комбинация АМРА-и ММЭА-антагонистов может иметь выраженный синергетический эффект, с более выраженным противосудорожным действием, чем при индивидуальном применении [11, 14, 15], поэтому в данной работе проверен противосудорожный эффект комбинации ИЭМ-1921 и ИЭМ-1925 при использовании электросудорожной модели. Во всех сериях опыта доза ИЭМ-1921 составил
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.