БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2015, том 41, № 1, с. 54-66
УДК 578.578.82/83
ПРОТОТИП ОЛИГОНУКЛЕОТИДНОГО МИКРОЧИПА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАТОГЕНОВ I ГРУППЫ, ОТНОСЯЩИХСЯ К СЕМЕЙСТВАМ ARENA- И FILOVIRIDAE
© 2014 г. И. В. Жирнов*, В. А. Рябинин*, А. Н. Синяков*- #, В. А. Терновой**, А. Н. Шиков**
*Новосибирский институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 8 **ФГУНГНЦВБ "Вектор"Роспотребнадзора, Новосибирская обл., Кольцово Поступила в редакцию 19.02.2014 г. Принята к печати 05.03.2014 г.
Предложен прототип олигонуклеотидного микрочипа для определения вирусов Lassa, Junin, Mach-upo, Guanarito (семейство Arenaviridae) и вирусов Ebola и Marburg (семейство Filoviridae). Для расчета гибридизационных зондов и праймеров был использован оригинальный подход, основанный на анализе аминокислотных последовательностей вирусных белков (нуклеокапсидного белка для вирусов Junin, Guanarito, Machupo и РНК-зависимой РНК-полимеразы для вирусов Lassa, Ebola и Marburg) с последующим перекодированием выявленных уникальных пептидов в соответствующие им наборы олигонуклеотидов.
Ключевые слова: аренавирусы, филовирусы, микрочипы, малобороздочный лиганд, диагностика.
DOI: 10.7868/S0132342314050133
ВВЕДЕНИЕ
Согласно классификации Всемирной организации здравоохранения к патогенам I группы относят инфекционные агенты, ассоциированные с тяжелыми и часто летальными заболеваниями у человека, для которых в большинстве случаев не существует эффективных лечебных и профилактических мер [1]. В данную группу, в частности, включены вызывающие геморрагические лихорадки вирусы Lassa (LASV), Junin (JUNV), Machupo (MACV), Guanarito (GTOV) и вирусы Ebola (EBOV) и Marburg (MARV). Быстрая лабораторная диагностика в тех случаях, когда может возникнуть предположение об инфекциях, ассоциированных с указанными патогенами, очень важна в развертывании системы противоэпидемических мероприятий. Вследствие этого актуальной задачей представляется разработка диагностических тест-систем, посредством которых возможно быстрое и точное выявление соответствующих инфекционных агентов.
Патогены I группы часто диагностируются серологически [2]. При использовании для диагностики быстро появляющихся в крови больных IgM тестирование осложняется кроссгибридиза-
# Автор для связи (тел.: (3832) 330-46-53, факс: (3832) 33336-77; эл. почта: sinyakov@niboch.nsc.ru).
цией между различными видами аренавирусов. Значительно более селективны нейтрализующие антитела, однако такие антитела появляются слишком поздно для ранней диагностики. Например, в крови больных, зараженные вирусом Ласса, нейтрализующие антитела не образуются на протяжении нескольких недель. В то же время смерть при заражении патогенами I группы часто наступает на 7—10 день после инфицирования.
Тесты, основанные на использовании цепной полимеразной реакции (ПЦР), можно использовать значительно раньше появления нейтрализующих антител в организме больного.
Такие тесты были разработаны в ряде работ [3, 4]. Этот метод также имеет существенные недостатки. Из-за высокой вариабельности вирусов практически для каждого штамма определяемого вируса требуется использовать свой собственный диагностический тест, содержащий праймеры для проведения амплификации и флуоресцентый зонд для выявления ампликона. Например, для выявления вирусов Lassa, Junin, Machupo, Gua-narito, Ebola и Marburg в работе [4] используется 41 вид диагностических наборов. Т.е. для определения конкретного вида вируса при лабораторном тестировании необходимо провести 41 анализ, что очень затратно и требует значительного времени исследования.
Перспективным и достаточно интенсивно развивающимся в последние годы направлением да-гностики является создание аналитических микрочипов. За короткое время это направление нашло приложение в различных областях: от исследований фундаментальных проблем молекулярной биологии и молекулярной эволюции до практического применения в медицине, фармакологии, экологии и судебно-медицинской экспертизе [5, 6].
Возможность параллельного анализа одного образца на множестве дискриминирующих зондов микрочипа представляется особенно важной для диагностики инфекций, ассоциированных с патогенами I группы, поскольку данный подход позволяет значительно снизить время анализа.
К настоящему времени разработан метод выявления вируса Lassa [7], использующий ПЦР с последующей гиридизацией полученных ампли-конов на микрочипе. Микрочип содержит 47 зондов длиной от 24 до 34 нуклеотидных звеньев, ти-пирующих все известные штаммы вируса Lassa. Такой способ позволяет одновременно определять все штаммы вируса Lassa, что значительно экономит время анализа. Недостатком этого метода является то, что он позволяет определить только вирус Lassa и не определяет другие вирусы, относящиеся к патогенам I группы.
Арена- и филовирусы могут быть также обнаружены с помощью GreeneChipVr [8]. Микрочипы этого типа содержат 60-членные олигонуклео-тиды в качестве типирующих зондов. Обычно для типирования выбирались три мишени в геноме вируса, включая нуклеотидные последовательности структурных белков. Подготовка образца и его анализ является довольно трудоемким и длительным процессом, включающим выделение РНК, проведение реакции обратной транскрипции с рассеянной затравкой, содержащей прай-мер для последующей амплификации кДНК, два раунда ПЦР — один для амплификации полученной кДНК, второй для введения специфической последовательности, необходимой для комплиментарного взаимодействия с дендримерами, содержащими флуоресцентные метки. Для анализа результатов гибридизации используется специальная программа. В целом диагностика с помощью GreeneChipVr, довольно дорога. К тому же использование в качестве гибридизационных зондов 60-членных олигомеров с неизбежностью приводит к потере специфичности зондов [9, 10].
Для преодоления проблем, связанных со специфичностью определения вирусных патогенов, фирмой "Аффиметрикс" (США) и Институтом Па-стера (Франция) был создан универсальный ресе-квенирующий микрочип PathogenID v. 2.0 [11]. Этот микрочип используется для выявления ряда высоко патогенных вирусов, в том числе принад-
лежащих к патогенов I группы. При этом достоверность определения вирусов с помощью этого микрочипа колеблется от очень хорошей (>97%, Lassa virus Guinea) до низкой (28.7%, Lassa virus Ivory Coast). Авторы отмечают, что с помощью данного микрочипа невозможно определить некоторые высоко дивергентные варианты вирусов [11].
В целом, несмотря на ряд очевидных достоинств микрочипов GreeneChipVr и PathogenID, эти универсальные микрочипы дороги в эксплуатации и не всегда обладают необходимой селективностью и достоверностью при определении патогенов I группы.
Целью настоящей работы являлось создание прототипа узкоспециализированного гибридиза-ционного микрочипа, способного выявлять только патогены I группы.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Эффективность микрочиповой диагностики, основанной на гибридизации анализируемой ДНК с дискриминирующими олигонуклеотид-ными зондами, зависит от правильного выбора последних. Задача поиска зондов решается достаточно просто для сильно различающихся по первичной структуре геномных последовательностей, например, при нахождении родоспецифич-ных зондов, и в большинстве случаев не представляет каких-либо проблем [12]. Однако задача поиска дискриминирующих зондов существенно осложняется при анализе близких по структуре нуклеотидных последовательностей, что, в частности, имеет место в случае одинаковых генов внутри семейства (Arena- или Filoviri-dae). Помимо этого, в отношении подбора зондов для дискриминации указанных патогенов имеют место дополнительные сложности, связанные с высокой вариабельностью геномов в пределах одного вида.
В Лаборатории медицинской химии ИХБФМ СО РАН был разработан новый подход для расчета гибридизационных олигонуклеотидных зондов в случае высоковариабельных вирусных геномов, основанный на анализе последовательностей вирусных белков. Данный метод был успешно использован для типирования вируса гриппа А [13]. Этот же подход было решено использовать в настоящей работе при расчете гибридизационных зондов в целях создания олигонуклеотидного микрочипа для выявления целевых инфекционных агентов. Фактически этот подход основан на поиске антигенных детерминант анализируемых вирусных белков.
Работа по расчету зондов включала в себя следующие этапы:
♦ Сбор данных по аминокислотным и нуклео-тидным последовательностям для JUNV, GTOV, MACV, LASV, EBOV и MARV.
♦ Отбор пептидных фрагментов вирусного белка, выбранного для анализа, являющихся общими для всех штаммов и изолятов данного патогена.
♦ Удаление из полученного набора пептидов тех, что присутствуют в аминокислотных последовательностях других целевых вирусов.
♦ Расчет олигонуклеотидных зондов исходя из структуры отобранных пептидов.
♦ Отбор оптимальной по размеру выборки олигонуклеотидных зондов, позволяющей с наибольшей вероятностью определять данный вирус.
♦ Удаление из полученного набора олигонук-леотидных зондов тех, введение в которые одной или двух точечных замен приводит к зондам на другие целевые вирусы.
♦ Отбор олигонуклеотидных зондов с оптимальной (входящей в определенный интервал) температурой плавления дуплекса, образуемого зондом и анализируемой ДНК.
В работе были использованы данные GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и Protein Sequence Database For Pathogenic Arenaviruses (http://epitope. liai.org:8080/projects/arena) [14] по нуклеокапсидно-му белку и РНК-зависимой РНК-полимеразе (для JUNV, MACV GTOV и LASV соответственно) и данные GenBank по РНК-зависимой РНК-по-лимеразе для EBOV и MARV. Выбор анализируемого белка во всех случаях определялся фактором наибольшей представительности соответствующих аминокислотных последовательностей в используемых базах данных.
В полученных из баз данных выборках аминокислотных последовательностей для всех штаммов и изолятов каждого из целевых вирусов выявляли идентичные участки длиной в 7 а.о. (согласно данным работы [12], выбор более длинных пептидов снижает колич
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.