ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 4, с. 408-413
УДК 579.253+579.812.11
ПРОЦЕСС РАСЩЕПЛЕНИЯ ПОПУЛЯЦИИ БАКТЕРИЙ НА ДИССОЦИАНТЫ И ДЛИТЕЛЬНОЕ ПЕРИОДИЧЕСКОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БАКТЕРИЙ
© 2014 г. Е. С. Милько, Д. М. Милько
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, Москва, 119899
e-mail: esmilko@mail.ru Поступила в редакцию 16.01.2014 г.
Изучены рост и состав популяции при длительном периодическом культивировании (до 50 сут) моно- и смешанных культур S- и М-диссоциантов Pseudomonas aeruginosa или R- и М-диссоциантов Rhodo-bacter sphaeroides без дополнительного внесения питательных веществ. При выращивании Р. aeruginosa на минеральной среде с глюкозой периодический лизис и последующее возобновление роста поликультуры в позднюю стационарную фазу происходили за счет М-диссоцианта, изменение численности которого соответствовало изменению общего количества клеток ассоциации. Показано, что периодическое появление в среде редуцирующих сахаров предшествовало возобновлению роста поликультуры.
Периодический вторичный рост смешанной культуры фотосинтезирующих бактерий R. sphaeroides происходил за счет быстрорастущих R-клеток, следовавший за лизисом части популяции R-диссо-цианта. В монокультуре М-диссоцианта R. sphaeroides R-клетки обнаруживались в течение всего времени культивирования, составляя 1 — 10% популяции вне зависимости от ее численности, что, вероятно, соответствовало частоте возникновения этого диссоцианта. В монокультуре R-диссоци-анта М-клетки выявлялись только после 26 сут, при этом их количество постепенно увеличивалось и к концу культивирования составляло половину популяции. Совместный рост диссоциантов по сравнению с монокультурами приводил к увеличению биомассы и ускорению роста бактерий, что важно в природных условиях для быстрого освоения новых мест обитания. Клетки обоих видов бактерий лизировались при длительном культивировании экзопротеиназами, выделяемые тонкостенными клетками М-диссоцтантов.
Б01: 10.7868/80555109914040254
Интерес к гетерогенности популяции бактерий, в том числе в условиях их длительного роста (поздняя стационарная фаза), связан с изучением механизмов адаптации бактерий к меняющимся условиям внешней среды, а также с необходимостью учитывать это явление в биотехнологических процессах, экологии, медицине [1—5]. Важнейший вклад в расщепление однородной популяции бактерий на варианты вносит процесс диссоциации (вариация фаз). Я-, 8- и М-диссо-цианты бактерий различаются физиолого-биохи-мическими и морфологическими свойствами и генетическими особенностями. Возникновение диссоциантов в популяции определяется, в основном, генетическими перестройками внутри клетки, которые происходят с высокой частотой 10-2—10-4 на одно клеточное деление. Одни из первичных фенотипических изменений при обратимых диссоциативных переходах происходят в клеточной оболочке: в размере и составе капсулы, клеточной стенки и цитоплазматической мембраны. Эти особенности клеток определяют по-
стоянные и обратимые изменения многих физио-лого-биохимических и морфологических свойств диссоциантов: потребность в питательных веществах и скорость роста, устойчивость к действию внешних факторов, синтез практически ценных веществ и др. [2, 3]. Максимальное количество экзометаболитов и экзоферментов образуют тонкостенные клетки М-диссоциантов: экзополиса-хариды, амилазы, липазы, нуклеазы [3], протеи-назы [6—8].
Преимущественный рост того или иного диссоцианта в развивающейся культуре определяется, с одной стороны, его питательными потребностями, а с другой — устойчивостью к изменяющимся физическим и химическим факторам окружающей среды [2, 3]. Чем ниже потребность клеток в питательных веществах, тем больше будет их удельное количество в смешанных культурах бактерий в стационарной фазе роста [9]. Так, сравнение физиолого-биохимических особенностей трех диссоциантов Pseudomonas aeruginosa показало, что у клеток R-диссоцианта преоблада-
Выживаемость клеток R- и М-диссоциантов R. sphaeruides после хранения
Срок хранения, сут R-диссоциант М -диссоциант
выжившие клетки, % состав популяции, % выжившие клетки, % состав популяции, %
R М R М
0 100 100 0 100 100 0
14 100 100 0 100 100 0
21 92 100 0 80 100 0
35 68 100 0 55 98 2
50 65 100 0 40 99 1
100 55 100 0 18 95 5
ет окислительный путь использования глюкозы, и они потребляют минимальное количество углерода, азота и фосфора [10, 11]. В клетках М-дис-социанта преобладают процессы брожения, поэтому они потребляют максимальное количество биогенов. S-клетки способны переключаться с одного пути использования глюкозы на другой. Соответственно, в стационарной фазе роста наибольшее количество клеток образует R-диссоци-ант, минимальное — М-диссоциант. Однако при снижении в среде одного из биогенных элементов селективными преимуществами обладают М-клет-ки: при уменьшении концентрации азота или фосфора популяция S-диссоцианта на 50—80% замещалась на М-диссоциант [12] Каковы фи-зиолого-биохимические особенности М-клеток, дающие им преимущества в росте в момент исчерпания питательных веществ из среды при максимальной среди диссоциантов потребности в углероде, азоте и фосфоре? Ответ на этот вопрос можно получить, исследуя развитие и состав популяции бактерий при длительном периодическом культивировании без пополнения питательных веществ. В таких условиях обычно находятся бактерии в естественных местах обитания.
Цель работы — изучение роста и изменений популяционного состава моно- и смешанных культур диссоциантов Pseudomonas aeruginosa и Rhodobacter sphaeroides в условиях длительного культивирования в периодическом режиме без дополнительного внесения источников питания.
МЕТОДИКА
Объектами исследованиями являются S- и M-диссоцианты Pseudomonas aeruginosa и R- и М-диссоцианты Rhodobacter sphaeroides.
Диссоцианты бактерии P. aeruginosa К2 выращивали на минеральной среде следующего состава (г/л): глюкоза — 20, азотнокислый натрий — 5, натрий фосфорнокислый однозамещенный — 0.5, хлористый калий — 0.6, сернокислый магний — 0.2, рН 7.2. Культуру выращивали в пробирках на
50 мл с 10 мл среды, на качалке (180 об/мин), при температуре 30° в течение 16 сут. В качестве посевного материала использовали клетки суточных культур диссоциантов, выращенных на ага-ризованной среде (МПБ + сусло, 1 : 1). Инокулят вносили в количестве 3%.
Диссоцианты пурпурной фотосинтезирующей бактерия R. shaeroides 2R из коллекции культур кафедры микробиологии МГУ им. М.В. Ломоносова выращивали на среде Ормерода в присутствии 0.2% малата во флаконах, доверху заполненных средой, в люминостате при 30°С. Суточную культуру использовали как посевной материал, который вносили в количестве 2%.
Число жизнеспособных клеток и соотношение диссоциантов в популяции определяли подсчетом колоний (КОЕ) на агаризованной среде (МПБ + сусло). Для каждого варианта опыта использовали по 10—12 чашек, на каждую из которых наносили по 0.1 мл суспензии соответствующего диссоцианта, разведенной в физиологическом растворе в 101—107 раз. Чашки выдерживали в люминостате в течение 1—2 сут при температуре 30°С.
Общую внеклеточную протеолитическую активность (ПА) определяли модифицированным методом Ансона [13] с использованием в качестве субстрата казеина. За единицу протеолитической активности принимали такое количество фермента, которое за 1 мин катализирует образование 1 мкг тирозина. Содержание глюкозы определяли с помощью индикатора "Диаглюк" ("Биосенсор АН", Россия) [7].
На графиках и в таблице представлены средние из 3 экспериментов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Рост и развитие смешанной культуры S- и М-диссоциантов P. aeruginosa исследовали на минеральной среде с глюкозой в течение 16 сут без дополнительного внесения питательных веществ (рис. 1). Показано, что за время культивирования
Глюкоза, мг%
pH
100
50
- 10
0 50 100 150 200 250 300 350 ч
Рис. 1. Динамика роста и состав популяции смешанной культуры (S + М)-диссоциантов P. aeruginosa при длительном культивировании: 1 — оптическая плотность культуры (ОП х 100); 2 — доля М-диссоцианта в популяции, %; 3 — рН среды; 4--содержание глюкозы, мг%.
рост бактерий возобновлялся 3 раза и осуществлялся, в основном, за счет М-диссоцианта, т.к. изменение его доли в популяции соответствовало изменению общего количества клеток смешанной культуры. Отмечено периодическое появление в среде редуцирующих сахаров, причем их обнаружение коррелировало со снижением процента М-клеток в популяции. При исчезновении сахаров доля М-диссоцианта увеличивалась. Следовательно, периодическое возобновление роста поликультуры P. aeruginosa в позднюю стационарную фазу роста происходило, в основном, за счет лизиса и последующего роста части клеток М-диссоцианта. Активность внеклеточной протеиназы M-клеток составляла 32 ед./мл, а S-клеток — 18 ед./мл.
Для сравнения был изучен рост М-диссоциан-та P. aerugirosa с S-диссоциантом другого вида бактерий — R. rubropertinctus [14]. Обе культуры являются активными разрушителями нефтяных загрязнений и часто вместе выделяются из естественных мест обитания [15]. Количество клеток в смешанной культуре этих бактерий в среде с гексадеканом в стационарной фазе на порядок выше и на неделю раньше достигало своего мак-
симума, чем в соответствующих монокультурах. При длительном культивировании (40 сут) этой ассоциации бактерий в среде с углеводородом [16] наблюдалось доминирование псевдомонад в популяции в стационарной фазе и при возобновлении роста. Родококки выявлялись только при снижении количества клеток до 2—5% от состава популяции. Следовательно, в бинарной культуре увеличение количества клеток по сравнению с монокультурой М-диссоцианта псевдомонад в стационарной фазе и при возобновлении роста в позднюю стационарную фазу происходило за счет лизиса части клеток родококка. Именно М-диссоциант P. aeruginosa синтезировал большое количество экзопротеиназ (32 ед./мл), в то время, как проте-иназная активность родококка составляла только 0.2 ед./мл у R-диссоцианта и 2 ед./мл у М-диссо-цианта [2]. Следует отметить, ч
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.