= БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 581.149
ПРОЦЕССЫ СТАРЕНИЯ И ОТМИРАНИЯ ПРОТОПЛАСТА ВОЛОКОН ЛЬНА: УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ1 © 2012 г. М. В. Агеева, Т. Е. Чернова, Т. А. Горшкова
Учреждение Российской академии наук Казанский институт биохимии и биофизики
Казанского научного центра РАН 420111 Казань, ул. Лобачевского, д. 2/31, а/я 30 E-mail: gorshkova@mail.knc.ru Поступила в редакцию 16.06.10 г.
Окончательный вариант получен 31.03.11 г.
Растительные волокна — специализированные клетки, выполняющие механическую функцию. В процессе своего развития они проходят стадии, характерные для большинства растительных клеток: закладка, рост клетки растяжением, дальнейшая специализация, старение и отмирание. На примере флоэмных волокон льна — классического объекта для анализа формирования волокон склеренхимы — проведен анализ ультраструктуры этих клеток на поздних стадиях развития - старения и отмирания. Обнаружено, что волокна льна сохраняют жизнеспособный протопласт в течение длительного времени, до конца вегетационного сезона. Признаки, характерные для апоптоза, в результате ультраструктурного анализа флоэмных волокон льна не выявлены. Постепенная деградация цитоплазмы начинается еще на фоне активного утолщения вторичной клеточной стенки и выражается в нарастании автолитических процессов, что приводит к частичной потере клеточного содержимого. Нарушение целостности тонопласта является финальной стадией. Полученные данные позволяют предполагать, что отмирание волокон льна происходит в процессе старения и программа их гибели имеет сходство с программой, реализующейся в волокнах ксилемы древесных растений.
Ключевые слова: волокна склеренхимы, ультраструктура, программируемая клеточная смерть, Ыпит usitatissimum.
ВВЕДЕНИЕ
Растительные волокна — структурно-функциональные элементы склеренхимы — механической ткани. Известно, что за период биогенеза волокна проходят все стадии, характерные для большинства растительных клеток: закладка, рост клетки растяжением, дальнейшая специализация, старение и отмирание. Исследования развития волокон фокусировались в основном на стадиях удлинения клетки и формирования мощной вторичной клеточной стенки, которые охарактеризованы с различных точек зрения, в том числе и ультраструктурной (Mellerowicz et al., 2001; His et al., 2001; Gorshkova et al., 2004; Salnikov et al., 2008; Bowling, Vaughn, 2009; Снегирева и др., 2010). Стадии старения и отмирания до сих пор исследованы слабо, при этом сроки и механизмы их осуществления получили противоречивые оценки. С одной стороны, волокна часто описывают как клетки, не имеющие живого протопласта и представляющие собой полые клетки, кото-
1 Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты №№ 08-04-00845; 09-04-00547).
рые отмирают достаточно рано (Раздорский, 1949; Тутаюк, 1980; Рейвн, 1990; Лотова, 2001). С другой стороны, как в середине прошлого века (Fahn, Arnon, 1962; Fahn, Leshem, 1963), так и в последнее время (Weiner et al., 1996; Gritsch et al., 2004; Gritsch, Murphy, 2005) появились работы, из которых следует, что волокна либриформа могут в течение нескольких лет сохранять живой протопласт. Особый интерес исследования поздних стадий развития волокон вызывают в связи с общими вопросами о механизмах отмирания растительных клеток. В недавно вышедшей работе старение и гибель ксилемных волокон некоторых видов Populus связывают с особым типом программируемой клеточной смерти, значительно отличающейся от происходящей в ксилемных сосудах (Courtois-Moreau et al., 2009). Этот вывод основывается на изучении ксилемных волокон древесных видов. В настоящем исследовании мы попытались ответить на вопросы, связанные со старением и отмиранием флоэмных волокон травянистых растений: как долго протопласты волокон остаются живыми и каков механизм их клеточной смерти? Анализ проведен на первичных флоэмных волокнах льна — классического объек-
та для исследования биогенеза волокон (Александров и др., 1932; Esau, 1943; Горшкова и др., 2003).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
В качестве объекта исследований использовали растения льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) сорта Новоторжский, выращенные в условиях вегетационного опыта с мая по октябрь в ящиках со слоем почвы 50 см на открытом воздухе при естественном освещении. Образцы для электронно -микроскопических исследований были взяты из средней части стебля (~50 см от гипокотиля) в фазы зеленой, желтой и полной спелости растений. Общая высота растений составляла 115—120 см. Растения, отобранные для фиксации в октябре и находившиеся в фазе полной спелости, имели желтый стебель, сухие метелки и коробочки; листья практически отсутствовали.
Отрезки стебля длиной 2 см предварительно фиксировали 2.5% глутаровым альдегидом на 0.05 М фосфатном буфере (pH 7.3) 3 часа при комнатной температуре. Затем вырезали короткие (0.4 см) участки из середины отрезка, разделяли их вдоль на 4 сегмента и фиксировали в 2.5% глутаровом альдегиде на 0.1 М фосфатном буфере в течение суток. Постфиксацию проводили в 1% тетраоксиде осмия с добавлением сахарозы (25мг/мл) при комнатной температуре в течение 5 часов. После дегидратации в серии спиртов постепенно повышающейся концентрации, ацетоне и окиси пропилена ткань заливали в Epon (Ted Pella Inc.). Срезы делали стеклянным ножом на ультрамикротоме LKB 8800 (Швеция). Контрастирование проводили в 2% водном растворе уранилацетата в течение 20 минут при комнатной температуре и цитратом свинца в течение 8 минут (Reynolds, 1963). Образцы просматривали на трансмиссионном электронном микроскопе JEM-1200EX (Jeol, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Первые признаки процесса деградации в цитоплазме флоэмных волокон льна были обнаружены уже в фазу зеленой спелости растения, хотя многие органеллы продолжали активно функционировать. В волокнах наблюдали ядра, вытянутые вдоль продольной оси клетки, с одним или несколькими ядрышками (рис. 1а). В цитоплазме волокон присутствовали диктиосомы и особые везикулы аппарата Гольджи с электронноплот-ным содержимым (рис. 1б), — характерные признаки активного формирования клеточной стенки желатинозного типа (Salnikov et al., 2008; Горшкова и др., 2010). Митохондрии и хлоропла-сты имели нативную структуру (рис. 1в, 1г). Однако уже встречались автолитические вакуоли с
разнородным содержимым (рис. 1д) и мультиве-зикулярные тела, свидетельствующие о частичной утилизации мембран. В большом количестве присутствовали крупные липидные капли различной электронной плотности, которые иногда формировали скопления, вдающиеся в вакуоль (рис. 1г). С одной стороны, вышеописанные признаки могут указывать на начинающийся процесс старения и отмирания волокна. С другой стороны, такая утилизация мембран может являться процессом, отражающим нормальную жизнедея-тель-ность клетки, которая вынуждена избавляться от излишков мембран, образующихся в результате интенсивной секреции полисахаридов клеточной стенки и сокращения объема цитоплазмы и вакуоли.
На более поздних стадиях развития растений (желтая и полная спелость) в некоторых участках волокон наблюдали сильную вакуолизацию и просветление цитоплазмы, появление цитосегре-сом (рис. 2а), большое количество автолитиче-ских вакуолей с разнородным содержимым и мультивезикулярные тела (рис. 2в, 2г). Размер цитоплазмы, по-видимому, сильно уменьшается как за счет сокращения люмена при утолщении клеточной стенки, так и за счет увеличения центральной вакуоли, происходящего в результате литических процессов. В итоге, немногочисленные органеллы прижаты к клеточной стенке (рис. 2д). Деградация наблюдалась и в хлоропла-стах, что выражалось в увеличении межмембранных промежутков тилакоидов и накоплении крупных осмиофильных глобул (рис. 2б; 3а). Однако в хлоропластах до самой поздней стадии были видны крупные крахмальные зерна, что свидетельствовало об их продолжающейся деятельности. В цитоплазме волокон присутствовали рибосомы (рис. 3б). Митохондрии имели ортодоксальный вид, среднюю плотность матрикса и многочисленные хаотично расположенные кри-сты (рис. 2в, 3б). В волокнах растений, находящихся в фазе желтой и полной спелости, ядра и митохондрии (рис. 2в; 3а, 3б, 3в) не отличались по структуре от таковых, обнаруженных в волокнах на более ранних стадиях развития.
В фазу полной спелости отмечались локальные разрывы тонопласта (рис. 3г). В этих участках наблюдался тотальный лизис цитоплазмы и органелл, приводящий к опустошению клетки (рис. 3д). Тем не менее, в том же волокне оставались области с сохранившейся цитоплазмой, рибосомами, ядром и другими органеллами (рис. 3а, 3б, 3в).
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Еще в середине прошлого века появились данные, свидетельствующие о том, что ксилемные волокна многих древесных растений могут в тече-
Рис. 1. Ультраструктур а волокон льна в фазу зеленой спелости растения: а — ядро с ядрышком; б — аппарат Гольджи; в — хлоропласт с развитой ламеллярной структурой и крахмальным зерном; г — митохондрия и липидные капли; д — автолитические вакуоли. АВ — автолитические вакуоли; АГ — аппарат Гольджи; ВГ — везикулы аппарата Гольджи; КС — вторичная клеточная стенка; Кр — крахмальные зерна; ЛК — липидные капли; М — митохондрия; Р — рибосомы, Хл — хлоропласт; Хр — хроматин; Я — ядро, Ядр — ядрышко. Масштабная линия: а — 1 мкм; б—д — 0.5 мкм.
ние нескольких лет сохранять живой протопласт (Fahn, Leshem, 1963). В качестве первого признака старения волокон либриформа гребенщика (Tamarix aphylla) описывают исчезновение крах-
мальных гранул (в 7—13-м годичном кольце); дольше всего в волокнах сохраняются ядра (в 17-м годичном кольце) (БаИп, Агпоп, 1962). Живые волокна были обнаружены в ротанговой
Рис. 2. Ультраструктура волокон льна в фазу желтой спелости растения: а — цитосегресома; б — деградация хлоропла-стов; в — митохондрия и цитосегресома; г — автофагия цитоплазмы; д — вакуолизация и уменьшение объема цитоплазмы (цитоплазма показана стрелками). АВ — автолитическая вакуоль; КС — вторичная клеточная стенка; М — митохондрия; МВТ — мультивезикулярное тело; Хл — хлор
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.