БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2011, том 37, № 6, с. 793-806
УДК 543.51 : 577.1 : 66.096.3
ПРЯМОЕ ВВЕДЕНИЕ ИЗОТОПОВ 18О В ПЕПТИДЫ И БЕЛКИ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА МЕТОДОМ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
© 2011 г. Ю. П. Козьмин*#, А. В. Манойлов**, М. В. Серебрякова***, О. А. Миргородская****
*Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН(ИБХРАН),
117997, Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 **Институт аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург ***Институт биомедицинской химии В.Н. Ореховича РАМН, Москва ****Научно-исследовательский институт гриппа, Санкт-Петербург Поступила в редакцию: 23.03.2011 г. Принята к печати: 03.05.2011 г.
Продемонстрирован метод прямого введения изотопов 18О в карбоксильные группы пептидов и белков, посредством обмена с Н218О в присутствии ТЕЛ. Изотопная метка достаточно устойчива в широком диапазоне рН. Благодаря тому, что меченные таким образом соединения сохраняют свои физико-химические характеристики, они могут быть использованы в качестве внутреннего стандарта при определении аутентичных соединений в анализируемых объектах методами масс-спек-трометрии. Методика может быть применима для количественного анализа пептидов и белков в биологических средах, для количественного изучения кинетики метаболизма и ферментативной активности. Количественный анализ полипептидов и белков комбинируется с триптическим гидролизом. При необходимости изотопная метка может быть введена сразу во все пептиды и белки контрольной биопробы, что делает ее пригодной в качестве стандарта для сравнительного анализа экспериментальных биопроб.
Ключевые слова: изотопный обмен 18О; белки; пептиды; количественный анализ; МЛЬВТ-МБ; ЕБ1-МБ.
ВВЕДЕНИЕ
Количественный анализ состава протеом в биомедицинских исследованиях является исключительно актуальной задачей [1, 2]. Выявление новых соединений или исчезновение отдельных компонентов протеом и изменения их концентраций может быть важно для понимания патологических процессов, а также в диагностических целях [3]. Среди различных методов, используемых для этих целей, масс-спектрометрия занимает особое место, т.к. именно этот метод является на сегодня единственным, который обеспечивает идентификацию отдельных компонентов протеом. В связи с этим представляется привлекательным привлечение масс-спектрометрии также и к количественному анализу протеом.
Очевидно, что в отношении чувствительности, достоверности идентификаций и универсальности подходов масс-спектрометрии нет равных. Однако в области количественных измерений здесь имеются сложности, обусловленные тем, что интенсивности сигналов не адекватны даже относительным
Сокращения: Л1Ь — альбумин человека; Лсд II — ангиотен-зин II, Ргс^ш — проинсулин человека, Tgn — бычий трип-синоген.
# Автор для связи (+7 (495) 336-07-77; эл. почта: zibotic@mai1.ru).
концентрациям, а абсолютные интенсивности не воспроизводятся. Вместе с тем, интенсивности изотопных распределений в масс-спектрометрах хорошо воспроизводятся и соответствуют теоретически рассчитанным отношениям. Это обстоятельство используется для количественных измерений, посредством внесения в качестве внутреннего стандарта соединения, химически идентичного измеряемому, но с отличающимся изотопным составом. Из интенсивностей изотопного распределения смеси анализируемого вещества и стандарта может быть вычислено их количественное соотношение [4, 5].
Таким образом, для проведения количественных измерений методом масс-спектрометрии необходимо получение индивидуальных стандартов для каждого анализируемого компонента [3, 6, 9]. Исключение составляют лишь аминокислоты, меченные стабильными изотопами, которые годятся в качестве стандартов для анализа продуктов полного кислотного гидролиза любых белков [11, 12]
Чаще всего такие стандарты приходится получать посредством химической модификации пептидов, в ходе которой изотопная метка "пришивается" по 8Н- или аминогруппам [9]. Аналогичной обработке подвергается и анализируемое соедине-
ние. Такая модификация сопровождается изменением химического строения анализируемых соединений и изменением их физико-химических характеристик. Кроме того, модификация белков, затрагивающая аминогруппы лизина, препятствует их трипсинолизу.
Мы предлагаем новую технологию получения стандартов для количественного анализа практически любых пептидов и белков (содержащих одну и более карбоксильных групп), свободную от перечисленных выше недостатков. Эта технология основана на изотопном обмене атомов 16О на 18О в карбоксильных группах пептидов и белков. Обмен затрагивает только кислород в свободных карбоксильных группах и не сопровождается изменением химической структуры молекулы. Реакция протекает в среде Н218О в присутствии трифторуксусной кислоты в качестве катализатора обмена [12]. Условия обмена выбираются такими, которые исключают гидролиз пептидных связей.
Эта технология в принципе позволяет получать стандарты из практически любых соединений, имеющих в своем составе свободные карбоксильные группы, поскольку замещение кислорода на более тяжелый его изотоп происходит именно здесь. Однако данная работа посвящена лишь частному случаю применения этой технологии для получения изотопно-меченных стандартов для пептидов, белков и их триптических гидролизатов, т.к. проблема нехватки стандартов для количественного анализа таких биоматериалов стоит чрезвычайно остро.
Очевидно, что количество обмениваемых атомов кислорода будет зависеть от количества присутствующих карбоксильных групп, следовательно, стандарты будут иметь разное содержание 18О. Поскольку изотопный обмен в каждой карбоксильной группе происходит независимо, то степень введения метки 18О оказывается выше для соединений с большим числом карбоксильных групп.
Особенностью предложенного метода количественного анализа является отсутствие необходимости доведения степени обмена до теоретически возможного предела. Более того, метод не требует строгого воспроизведения степени введения изотопной метки при повторном приготовлении стандарта, а нуждается лишь в экспериментальном измерении масс-спектра вновь полученного стандарта для получения информации об его реальном изотопном распределении. Это позволяет успешно использовать в качестве внутреннего стандарта продукты изотопного обмена в широком диапазоне доли включаемого изотопа 18О.
Для вычисления результатов количественного анализа нами разработан математический алгоритм, учитывающий фактический изотопный состав используемого внутреннего стандарта.
Настоящая работа иллюстрирует предложенный метод на примере смеси модельных пептидов и белков.
РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТА И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее [10] мы продемонстрировали возможность получения подходящих 18О-меченных стандартов для ряда аминокислот путем обмена с водой Н218О в кислой среде. Было показано, что при инкубации Lys, Arg, His, Phe и Tyr в Н218О в присутствии 20% TFA при 20°С в течение 5—7 сут (или при 100°С — 8 ч) в карбоксильных группах более 75% 16О обменивалось на 18О. Представляло интерес использовать подобную процедуру для введения изотопов 18О в карбоксильные группы пептидов и белков.
Для экспериментальной оценки возможности введения 18О в карбоксильные группы был использован ацетилированный ^-концевой фрагмент пептида, образующегося при болезни Альцгейме-ра — Ac-Aß(1—5). В этом пептиде (AcDAEFR) присутствуют карбоксильные группы трех типов. Две принадлежат двухосновным аминокислотам — Asp и Glu, а третья С-концевому аминокислотному остатку. Результаты эксперимента представлены на рис. 1, где приведен масс-спектр этого пептида до и после обмена.
Как следует из представленных данных по изотопному распределению (рис. 1б), после обмена в течение 100 мин при 50°С в 7% TFA только в около 6% от взятого в эксперимент пептида, не произошло включение изотопа 18О. При этом образуются несколько форм пептида с содержанием от 1 до 4 атомов 18О в количестве 22, 38, 24 и 6%, соответственно. Важно отметить, что в использованных условиях обмена для этого пептида масс-спектро-метрически не было зарегистрировано продуктов его гидролиза.
Для данного пептида максимальное число атомов кислорода 16О, которое может быть обменено, равно 6, а в приведенном выше эксперименте среднее число внедренных атомов изотопа 18О («18O) близко к двум. Как будет показано далее, такой степени включения вполне достаточно для использования продукта обмена в качестве внутреннего стандарта.
Неполнота включения изотопа 18О для данного случая позволила провести дополнительное сравнение степени обмена в свободных карбоксильных группах всех трех типов (на С-конце и при остатках Asp и Glu), используя для этой цели фрагментацию цепи посредством MALDI-MS/MS (рис. 2).
Среди фрагментов изотопомера этого пептида интерес для нашей цели представляли ионы (рис. 2б), соответствующие отдельным аминокислотным остаткам, содержащим свободные карбок-
679.3
683.3 (б)
681.3
678 679 680 681 682 683 684 685 686 687 688 689 690
m/z
Рис. 1. MALDI-масс-спектр пептида Ac-Aß(1—5) до обмена (а) и после обмена в течение 100 мин при температуре 50°С в 7% TFA (б)
иммониевые Е
Ac-Aß(1-5)
100
200
300
400
500
600
700
m/z
Рис. 2. Фрагменты спектра MALDI-MS/MS пептида Лс-ЛВ(1—5) (а), получаемого из него стандарта (б), а также смеси образца и этого стандарта в соотношении 2:5 (в). Фрагменты обозначены в соответствии с общепринятой нотацией [15].
сильные группы. Это остатки Glu (m/z = 102.06) и группу. Сравнение между собой степеней включения
AcAsp (m/z = 158.04), имеющие карбоксильную изотопа 18O в карбоксильные группы каждого из этих
группу в боковой цепи; и остаток С-концевого Arg трех типов обещало дать информацию о влиянии ти-
(m/z = 175.12), сохранившего свою карбоксильную па группы на скорость включения изотопа.
H 1
1 O
1б
O—H
t ï
O -— H
/18
H 18
H I
O
-+C.
I t
1б
:O—H
sOi
-H
H
Рис. 3. Предполагаемая схема изотопного обмена.
Результат измерения оказался крайне интересным, т.к. показал заметную разницу между скоростью включения 18O в карбоксильные группы разного типа. В станда
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.