научная статья по теме ПЦР-АМПЛИФИКАЦИЯ ДНК С ПОМОЩЬЮ ПРАЙМЕРОВ “ВСТЫК” Биология

Текст научной статьи на тему «ПЦР-АМПЛИФИКАЦИЯ ДНК С ПОМОЩЬЮ ПРАЙМЕРОВ “ВСТЫК”»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 4, с. 628-637

ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА

УДК 577.2.08

ПЦР-АМПЛИФИКАЦИЯ ДНК С ПОМОЩЬЮ ПРАЙМЕРОВ "ВСТЫК"

© 2015 г. Р. Р. Гарафутдинов*, А. А. Галимова, А. Р. Сахабутдинова, В. А. Вахитов, А. В. Чемерис

Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, Уфа, 450054

Поступила в редакцию 18.12.2014 г.

Принята к печати 26.01.2015 г.

В последние годы повышен интерес к анализу ДНК "сложных" биологических объектов, к которым можно отнести различные биоматериалы, взятые из окружающей среды (сточные воды, почва, археологические находки, криминалистические образцы и т.п.). ДНК, выделенная из подобных объектов, часто мало пригодна для анализа из-за нарушения целостности ее структуры. Один из способов обнаружения специфических фрагментов нуклеиновых кислот из таких объектов — амплификация с помощью полимеразной цепной реакции с системой сближенных праймеров. В представленной работе приведены результаты изучения особенностей протекания полимеразной цепной реакции при использовании прай-меров "встык", т.е. таких, З'-концы которых отжигаются на смежных нуклеотидах комплементарных цепей матрицы. Показано, что подобное расположение праймеров обеспечивает получение требуемых продуктов при большей чувствительности и меньшей продолжительности реакции. На искусственно разрушенной ДНК и ДНК, выделенной из почвы, показано, что только праймеры "встык" обеспечивают уверенное выявление специфичных фрагментов. Установленные закономерности протекания ПЦР с праймерами "встык" могут быть использованы при работе с разрушенной (фрагментированной) ДНК.

Ключевые слова: амплификация, полимеразная цепная реакция, разрушенная ДНК, праймеры "встык", специфичность.

DNA AMPLIFICATION USING PCR WITH ABUTTING PRIMERS, by R. R. Garafutdinov*, A A. Gali-mova, A. R. Sakhabutdinova, V. A. Vakhitov, A. V. Chemeris (Institute of Biochemistry and Genetics, Ufa Science Centre, Russian Academy of Sciences, Ufa, 450054 Russia; *e-mail: garafutdinovr@gmail.com). DNA analysis of complex biological objects (wastewater, soil, archaeological and forensic samples, etc.) is now of great interest. DNAs of such objects are characterized by low suitability for research due to violation of its integrity and chemical structure thereby the detection of specific nucleic acid fragments can be achieved by PCR with contiguous primers. In this paper we present the results that clarify the specific characteristics of PCR with abutting primers. The 3'-ends of such primers are annealed at adjacent nucleotides of complementary chains of DNA target. It was shown that the proximity of primers allows the formation of specific reaction products with a higher sensitivity and less reaction time. Using artificially damaged DNA and DNA from the soil we demonstrated that the abutting primers provide assured detection of specific DNA fragments. The results of this work may be taken into account in PCR with degraded (fragmented) DNA.

Keywords: amplification, PCR, degraded DNA, abutting primers, specificity. DOI: 10.7868/S0026898415040059

Современные методы молекулярной диагностики различных заболеваний [1, 2], анализа объектов окружающей среды [3, 4] и продуктов питания [5—7], а также методы, применяемые в экс-пертно-криминалистической деятельности [8, 9], основаны, в первую очередь, на обнаружении специфических фрагментов нуклеиновых кислот (НК). Как правило, фрагменты ДНК выявляют с помощью амплификации НК in vitro, позволяющей увеличить количество исходной НК-мишени

до уровня, обеспечивающего ее уверенное обнаружение инструментальными методами. Наиболее часто в диагностических целях используется полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая характеризуется значительными возможностями при относительной простоте, высокой чувствительности, надежности и низкой себестоимости.

Практически сразу же после появления ПЦР около 30 лет назад [10, 11] были предложены различные ее варианты, направленные на решение

Принятые сокращения: НК — нуклеиновые кислоты; ПЦР — полимеразная цепная реакция; ДДС — додецилсульфат натрия; ЦТАБ — цетилтриметиламмония бромид; БОТА — динатриевая соль К,К,№,№-этилендиаминтетраукусной кислоты.

* Эл. почта: garafutdinovr@gmail.com

конкретных задач, в которых использование классической ПЦР не приводило к желаемому результату [12—15]. Среди них следует отметить необходимость анализа "сложных" объектов (НК-мат-риц), под которыми мы подразумеваем смесь ДНК (искомая + фоновая), разрушенную ДНК (из старых/древних биоматериалов или подвергшихся химическому и/или физическому воздействию), низ-кокопийную ДНК (единичные молекулы ДНК). В каждом из этих случаев анализ становится нетривиальной задачей, требующей методических отклонений от традиционных подходов. Так, для многокомпонентных систем (например, почва, природные и сточные воды, медицинский мазок) актуально выявление специфических нуклеотид-ных последовательностей на фоне значительного количества "балластной" ДНК [16, 17]. Обнаружение специфических фрагментов ДНК имеет важное значение в криминалистике и археологии, однако образцы, с которыми приходится работать, насчитывают иногда десятки, сотни и даже тысячи лет, а генетический материал в них находится в неудовлетворительном состоянии. Неоднократно было показано, что неточности и ошибки амплификации протяженных фрагментов ДНК вызывают существенные затруднения при идентификации личности [9]. Необходимость анализа сильно фрагментированной ДНК обусловила разработку ряда альтернативных подходов [18—21] однако в то же время изучалась возможность обнаружения коротких специфичных фрагментов ДНК с помощью традиционной ПЦР с измененными условиями проведения. Предложена теоретическая модель оценки эффективности ПЦР, которую можно применить для определения минимального размера анализируемого фрагмента [22]. Работоспособность этой модели экспериментально показана на искусственно разрушенной ДНК. Изучено также влияние химических агентов, используемых для фиксации тканей (формалин и парафин), на эффективность ПЦР [23]. Формалин вызывает нарушение структуры НК (сшивки, депуринизация и другие), делая невозможной ПЦР-амплификацию НК из таких образцов. Показано также, что даже небольшие изменения состава реакционной смеси и применение сближенных праймеров обеспечивают успешное протекание ПЦР [23].

Учитывая предпочтительность амплификации коротких фрагментов при работе с разрушенной ДНК, наиболее очевидно использование ПЦР с максимально сближенными праймерами. Описан вариант ПЦР, в котором для мониторинга протекания реакции используется FRET-эффект (резонансный перенос энергии флуоресценции), возникающий между прямым и обратным прай-мерами, расположенными "встык" и меченными донорно-акцепторной парой красителей [24]. Практически одновременно была запатентована платформа UFA (Universal Fluorescence Amplifi-

cation), основанная на том же принципе [25]. Однако систематическое детальное изучение ПЦР со сближенными праймерами не проводилось, что обусловлено, вероятно, опасениями, связанными с возможностью образования диме-ров праймеров при амплификации. Действительно, на практике приходится иногда сталкиваться с накоплением димеров праймеров, что наблюдается, как правило, при длительной амплификации (40 и более циклов) и/или при "неоптимальной" последовательности праймеров. Предложен простой подход к устранению данного недостатка ПЦР, заключающийся в конструировании специальных праймеров, удлиненных с 5'-конца идентичными фрагментами ДНК [26].

Цель нашей работы заключалась в изучении особенностей протекания ПЦР с использованием системы праймеров, расположенных встык, т.е. таких, З'-концы которых отжигаются на смежных нуклеотидах комплементарных цепей матрицы, а также в оценке применимости данного подхода для амплификации потенциально фрагментиро-ванной ДНК.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использованы реактивы: 5-(этилтио)-1^-тетразол, амидофосфиты (dA-CE, dC-CE, dG-CE, dT-CE), носители для синтеза олигонук-леотидов (dA-CPG, dC-CPG, dG-CPG, dT-CPG) (все "Glen Research", США); абсолютные ацето-нитрил и тетрагидрофуран квалификации для синтеза ДНК ("Panreac", Испания); акриламид, ^№-метиленбисакриламид, Трис, персульфат аммония, динатриевая соль ^^№,№-этиленди-аминтетраукусной кислоты (EDTA), N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин, додецилсульфат натрия (ДДС), цетилтриметиламмония бромид (ЦТАБ) (все "AppliChem," Германия); агароза ("Amresco", Россия); Taq-ДНК-полимераза ("Fermentas", Литва), dNTP ("СибЭнзим", Россия), SYBR Green I ("Биотех-Индустрия", Россия). Для приготовления всех растворов использовали воду высшей категории качества (>18 МОм) ("Millipore", США).

Олигонуклеотидные прай меры подбирали на основе нуклеотидных последовательностей, депонированных в GenBank [27], с использованием online-утилиты OligoAnalyzer компании "Integrated DNA Technologies" [28]. Праймеры синтезировали на автоматическом ДНК-синтезаторе ASM-800 ("Биоссет", Россия) амидофосфитным способом и очищали методом гель-электрофореза в 15%-ном полиакриламидном геле. Концентрацию всех нуклеиновых кислот определяли по оптической плотности водного раствора при 260 нм на спектрофотометре BioSpec-Mini ("Shimadzu", Япония). Последовательности использованных в работе праймеров представлены в таблице.

В качестве ДНК-матриц использовали суммарную ДНК пчелы медоносной (Apis mellifera), богомола обыкновенного (Mantis religiosa), человека (Homo sapiens), ели сибирской (Picea obovata), а также суммарную ДНК из почвы. ДНК пчелы и богомола выделяли из мышечной ткани насекомых с помощью коммерческого набора ДНК-Экс-тран-2 ("Синтол", Россия) строго по протоколу производителя. ДНК человека выделяли с использованием фенольно-хлороформной экстракции из цельной периферической крови [29]. ДНК ели получали ЦТАБ-методом [30] с небольшими изменениями. Навеску свежей хвои массой около 50 мг растирали в жидком азоте, переносили в пробирку типа eppendorf объемом 2 мл, добавляли 400 мкл ЦТАБ-буфера, 10 мкл РНКазы А (10 мг/мл), тщательно перемешивали на вортексе и инкубировали

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком