БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2015, том 41, № 1, с. 124-128
^ ПИСЬМА
РЕДАКТОРУ
УДК 578.832.1
ПЦР НА МИКРОЧИПЕ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУБТИПОВ ВИРУСА ГРИППА А, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В ЧЕЛОВЕЧЕСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ © 2015 г. Е. В. Костина*, #, В. А. Рябинин*, В. А. Терновой**, А. Н. Синяков*
*Новосибирский институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 8 **ФГУНГНЦВБ "Вектор"Роспотребнадзора, 630559, Новосибирская обл., Кольцово Поступила в редакцию 01.07.2014 г. Принята к печати 28.07.2014 г.
Разработан олигонуклеотидный микрочип для определения субтипов вируса гриппа А, циркулирующих в человеческой популяции: НШ1 (сезонный до 2009 г.), НШ1 (пандемический 2009 г.), Н5№, Н2№, Н3№, Н9№, Н7№. Типирование вируса гриппа проводится методом ПЦР на микрочипе. Используются иммобилизованные праймеры-зонды, рассчитанные для гена нейраминидазы, которые позволяют определять не только субтип нейраминидазы, но и субтип гемагглютинина.
DOI: 10.7868/S013234231501008X
Среди вирусов, способных вызывать эпидемические вспышки, особую опасность представляют вирусы гриппа А. В настоящее время известно 18 субтипов гемагглютинина и 11 субтипов нейраминидазы [1]. Но наибольшую опасность представляют те, что циркулируют в человеческой популяции (H1N1 сезонный, H1N1 свиной, H3N2, H2N2) или способны инфицировать человека, но не вызывающие пока существенных эпидемических вспышек (H5N1, H1N2, H7N9, H9N2). Ранее были разработаны различные варианты ги-бридизационных микрочипов для типирования вируса гриппа А [например, 2—4]. Все эти варианты включают в себя предварительное получение кДНК анализируемого образца, последующую амплификацию определенного фрагмента и гибридизацию полученного ампликона на микрочипе, несущем типирующие зонды. Еще одним направлением является метод ПЦР на твердой фазе, использующий удлинение иммобилизованных на микрочипе зондов с включением флуоресцентной или биотиновой метки (частным случаем этого подхода является APEX с присоединением одного меченого основания) [5—7]. В рамках настоящей работы нами решалась задача типиро-вания вируса гриппа А, циркулирующего в человеческой популяции, методом ПЦР на микрочипе с использованием типирующих праймеров-зондов, найденных для гена нейраминидазы, но позволяющих определять субтип и нейраминида-зы и гемагглютинина.
Для нахождения специфических праймеров нами использовалась база данных Influenza virus
#Автор для связи (тел.: +7 (3832) 363-51-72, эл. почта: kostinaelena@mail.ru).
resources [1]. Рассматривались изоляты гриппа, выделенные от человека начиная с 2007 года (около 25000). В основном, они представлены субтипами H1N1 (сезонного до 2009 г. и пандемического 2009 г.) и H3N2, в меньшей степени субтипами H5N1, H2N2, H1N2, H7N9, H9N2 (всего около 600) и лишь несколькими субтипами H7N3, H7N2, H7N7 (суммарно около 10). В связи с этим нами рассматривалась возможность определения субтипов H1N1, H1N1sw, H3N2, H5N1, H2N2, H1N2, H9N2, H7N9, а для последней группы расчета не проводилось. Для нахождения праймеров-зондов использовалось модифицированное программное обеспечение, описанное в работе [2]. В результате было найдены праймеры-зонды, позволяющие дискриминировать субтипы вируса гриппа. Зонды, представительные для определяемого субтипа гриппа, отличались по структуре от зондов для других субтипов, либо двумя и более заменами, либо одной заменой, но расположенной в центральной части зонда. Исключением являются субтипы H1N2 и H3N2, для которых не удается найти различающиеся зонды вследствие высокой гомологии нук-леотидных последовательностей нейраминидазы. Структуры зондов приведены в таблице.
Для иммобилизации олигонуклеотидных зондов на микрочипе на 5'-конец вводился аминоал-кильная группа аналогично тому, что описано в работе [2, 3]. Предварительные исследования показали, что наращивание цепи протекает недостаточно эффективно, если протяженность лин-керной части между олигонуклеотидом и поверхностью невелико (например, при использовании линкера из шести атомов). Подобный эффект описан в работе по кинетике гибридизации-дена-
Структура олигонуклеотидных праймеров-зондов для выявления субтипов вируса гриппа А, циркулирующих в человеческой популяции
Субтип вируса гриппа Зонд (5'—3')
H1.N1 GTTCAAATCGACCTTGGGTGTCTT TAGGATACATCTGCAGTGGAGTGT CAGGATTGGACTGTATAAGACCTTGC GGTTTGAGATGATTTGGGATCCTAATG
НШ^ ATGGACAGGCCTCATACAAGATC GTCAAATCAGTCGAAATGAATGCC ATCGTCTAATGGAGCAAATGGAGT CCTTGCTTCTGGGTTGAACTAATCA
НШ2 + №N2 TCGATATCCTGGTGTCAGATGTGT CTGGGCCTTTGATGATGGAAATGA CAAAGTCATTGAAGGCTGGTCCAA AGGAGCGGCTTTGAAATGATTTG
Н5№ TTTGTCCAGCATCCAGAACTGAC GCAGGCATCATATAAGAГСTГСAAAAГО
Н7Ш TGGACCTGCAGACACAAGAATATAC TCGATGTGTTCCAGTACAGAATTCC ACAATTGGCAGGGCTCAAATAGA
Н9Ш TCAGGTTATGAGACTTTCAGGGT GCATCAACAGGTGTTTTTATGTAGAG ACGGTAGTAATGACAGATGGAAGT AGAGAGGGGAAAATCGTACACATTAG
Н2Ш CTTTCAAAGTCATTGGTGGTTGGT ACTAGAGTATGGTGGACCTCAAAC GGAAGAGCCGATACTAGAATACTATTC CGCTCAGGTTATGAAACTTTCAAAGT
турации олигонуклеотидных дуплексов [6]. В связи с этим, нами на 5'-конец иммобилизуемого прайме-ра-зонда вводилось дополнительно 8 остатков три-этиленгликольфосфата и таким образом длина линкерной части, с учетом аминогексильного линкера, достигала 96 атомов. Это позволило существенно увеличить уровень наработки иммобилизованного ампликона (почти в 10 раз, данные не приведены).
Нами было рассмотрено два варианта проведения ПЦР на микрочипе:
1) типирующий праймер-зонд иммобилизован и используется в качестве прямого праймера, а обратный универсальный праймер находится в амплификационной смеси. Таким образом, наработка прямой цепи ампликона происходит только на поверхности микрочипа.
2) в амплификационную смесь дополнительно добавлена смесь специфичных прямых прайме-ров. В этом случае наработка прямой цепи происходит как на поверхности, так и в растворе.
Предпочтительным оказался второй вариант проведения ПЦР, позволяющий повысить чувствительность метода в 5 и более раз (данные не приведены). В дальнейшем наработка ампликона проводилась в асимметричном режиме с использованием в амплификационной смеси универсального обратного праймера и набора прямых специфичных праймеров в соотношении 10 : 1. Флуоресцентная метка вводилась в процессе ПЦР при помощи тетраметилродамин-дезоксиуридин-5'-трифосфа-та. Матрицей служили как предварительно полученные полноразмерные ампликоны гена нейрами-нидазы, так и кДНК.
Экспериментальные процедуры по выделению РНК, проведению обратной транскрипции, получению полноразмерных ампликонов нейрами-нидазы, печати микрочипов и визуализации проводились аналогично [2, 3].
Микрочип был протестирован на образцах НШ1, H1N1sw и И3М2, использованных нами в работе [2], а также H1N1sw (Глазго, 2014) и Н5№
126
КОСТИНА и др.
(а)
A В С D Е F G И I
(б)
• • О • •
1 2 3 4 5 6 7 8
0.5
0
1 1 2 2 2 9
Ъ Ъ Ъ Ъ Ъ
1 5 2 3 9 7
53 53 53 53 53
(в)
(г)
1.5
1.0
0.5
1.5
1.0
0.5
! %
я
§
|
Ъ Я
1 2 2 2 9
Ъ Ъ Ъ Ъ Ъ
5 2 3 9 7
53 53 53 53 53
а
1 1 2 2 2 9
Ъ Ъ Ъ Ъ Ъ Ъ
1 5 2 3 9 7
53 53 53 53 53 53
а
Дизайн микрочипа (а), результаты ПЦР на микрочипе (слева) и соответствующие им гистограммы средней флуоресценции спотов (справа) (б—е). (а) - A1, Л2, A7, Л8, 11, 12, 17, 18 — контроль качества печати; A3-A6, В7, В8, Б7, Б8, Н7, И8, 13—16 — отрицательный контроль (К). Типирующие зонды (печать в двух повторах): В1—В8 — H1N1sw; С1—С8 — И1N1; Б1-Б6 - Н5№; Е1-Е8 - И2N2; Ш-Р6 - И3N2; 01-08 - Н9№; И1-И6 - И7N9. (б) - НШ^ A/Glasgow/2014; (в) -НШ1 A/Novosibirsk/1/2009; (г) - И5N1 A/Gonkong/2012; (д) - И3N2 A/Wlsconsin/67/2005; (е) - НШ^ A/Mos-cow/IIV04/2009. В качестве матрицы использовались полноразмерные ампликоны нейраминидазы (б—д) и кДНК (е).
0
0
Рис. 1. Окончание.
(Гонконг, 2012), предоставленных ФГУН "Вектор". Расположение зондов на микрочипе и картины накопленного сигнала при проведении амплификации для субтипов H1N1, H1N1sw, H5N1, H3N2 приведены на рисунке. Можно видеть, что типирование протекает однозначно при анализе как предварительно наработанного ампликона, так и при использовании кДНК.
К сожалению, нам не удалось протестировать редко встречающиеся субтипы H2N2, H9N2, H1N2, H7N9 ввиду отсутствия образцов, выделенных от человека. Но можно видеть, что зонды, рассчитанные для этих субтипов не дают ложно-положительных сигналов при типировании субтипов гриппа H1N1, H1N1sw, H5N1, H3N2.
Таким образом, предлагаемый нами подход позволяет, используя зонды, найденные в нуклео-тидной последовательности гена нейраминида-зы, определять субтипы и нейраминидазы, и гемагглютинина. При этом процесс амплификации и введение флуоресцентной метки происходит непосредственно на микрочипе, что существенно упрощает схему определения субтипа гриппа по сравнению с аналогичной процедурой с использованием гибридизационных микрочипов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Influenza Virus Resource http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ genomes/FLU/FLU.html
2. Ryabinin V.A., KostinaE.V., MaksakovaG.A., NeverovA.A., Chumakov K.M., Sinyakov A.N. // PLoS ONE. 2011. 6(4): e17529. doi:10.1371/journal.pone. 0017529.
3. Ryabinin V.A., Kostina E.V., Sinyakov A.N. // Russ. J. Bioorgan. Chemistry. 2013. V 39. P. 338-340. (Ряби-нин В.А., Костина Е.В., Синяков А.Н. // Биоорган. химия. 2013. Т. 39. С. 378-380.)
4. Fesenko E.E., Kireyev D.E., Gryadunov D.A., Mikhailov-ich V.M., Grebennikova T.V., L'vovD.K.,ZasedatelevA.S. // Influenza and other respiratory viruses. 2007. V. 1. P. 121-129.
5. Khodakov D.A., Zakharova N.V., Gryadunov D.A., Filatov F.P., Zasedatelev A. S., Vladimir M. Mikhailov-ich V.M. // BioTechniques. 2008. V. 44. P. 241-248.
6. Pemov A., Modi H., Chandler D.P., Bavykin S. // Nucleic. Acids Res. 2005. V 33. № 2. e11. doi:10.1093/ nar/gnh184.
7. Sun Yi., Dhumpa R., BangD.B., HandbergcK., Wolff A. // Diag. Micr. Infec. Dis. 2011. V. 69. P. 432-439.
8. Shchepinov M.S., Case-Green S.C., Southern E.M. // Nucleic Acids Res.1997. V. 25. P. 1155-1161.
128
KOCTHHA h gp.
On-Microchip PCR for Detection of Influenza A Viruses Subtypes, Circulating in the Human Population
E. V. Kostina*, #, V. A. Ryabi
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.