БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 5, с. 746 - 753
УДК 571.27
ОЧИЩЕННАЯ МИТОХОНДРИАЛЬНАЯ ДНК НЕ СПОСОБНА АКТИВИРОВАТЬ НЕЙТРОФИЛЫ ЧЕЛОВЕКА in vitro
© 2015 А.С. Приходько1, А.К. Шабанов2, Л.А. Зиновкина1, Е.Н. Попова3, М.А. Азнаурян1, Н.О. Ланина1, М.В. Витушкина4, Р.А. Зиновкин3,4*
1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, факультет биоинженерии и биоинформатики, 119991 Москва 2 Институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского, 129010 Москва
3 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991 Москва
4 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119991 Москва; факс: +7(495)939-0338,
электронная почта: roman.zinovkin@gmail.com
Поступила в редакцию 22.12.14 После доработки 22.01.15
Чрезмерная активация врожденного иммунитета зачастую приводит к фатальным последствиям и может рассматриваться как один из вариантов феноптоза. При тяжелых травмах в кровоток попадают различные компоненты митохондрий, которые могут стимулировать миелоидные клетки врожденного иммунитета. Одним из таких стимуляторов предположительно может выступать митохондриальная ДНК (мтДНК) [1]. В настоящей работе была исследована роль мтДНК как непосредственного активатора нейтрофилов человека, а также как прогностического маркера у больных с тяжелой травмой. Количественное определение концентрации мтДНК в плазме больных с тяжелой травмой показало ее статистически значимое (р < 0,02) повышение у группы не выживших пациентов по сравнению с выжившими. В то же время высокоочищенные препараты мтДНК оказались не способны вызывать активацию нейтрофилов человека, что может указывать на существование дополнительных факторов, обеспечивающих узнавание мтДНК как «образа опасности».
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: травма, внеклеточная ДНК, митохондриальная ДНК, активация нейтрофилов.
Известно, что при травме в кровоток попадает содержимое разрушенных клеток, в т.ч. компоненты митохондрий. Они могут функционировать в качестве эндогенных «образов опасности», ассоциированных с повреждением (Damage-associated molecular patterns, DAMPs), и инициировать воспаление, которое в ряде случаев приводит к развитию опасных для жизни осложнений [1]. Предположительно активация клеток иммунной системы с помощью митохондриаль-
Принятые сокращения: мтДНК — митохондриальная ДНК; внДНК — внеклеточная ДНК; яДНК — ядерная ДНК; DAMP — «образы опасности», ассоциированные с повреждением (Damage-associated molecular patterns); MTD - митохондриальные DAMP; fMLP - formyl-Met-Leu-Phe; ISS — шкала тяжести повреждений (Injury Severity Score); Р-р38 — фосфорилированная форма МАРК р38; ММР9 — матриксная металлопротеиназа (Matrix metallo-proteinase 9).
* Адресат для корреспонденции.
ных DAMP (MTD) вызывается: 1) митохондри-альными белками, несущими на ^-концах фор-милметионин, что типично для бактериальных белков; 2) митохондриальным кардиолипином; 3) АТФ; 4) митохондриальной ДНК (мтДНК), обладающей многими свойствами прокариоти-ческой ДНК [1, 2]. Внеклеточная ДНК (внДНК) в плазме крови представлена в основном ядерной (яДНК) и мтДНК. Показано, что повышение концентрации внДНК наблюдается при множестве патологических состояний [3]. Повышение концентрации мтДНК в крови пациентов с травмой может являться потенциальным прогностическим маркером [4, 5], коррелирующим с тяжестью травмы и смертностью [6, 7].
В подавляющем большинстве работ, посвященных изучению мтДНК, исследователи оперируют относительными, а не абсолютными значениями концентраций. Точное определение концентраций мтДНК может помочь система-
тизировать результаты, полученные в разных исследованиях, а также разобраться в механизме действия этих нуклеиновых кислот как DAMP. В настоящей работе мы исследовали данный вопрос с помощью количественного определения внеклеточной ДНК в плазме крови 34 больных с тяжелой травмой.
Остается неясным, способна ли мтДНК в концентрациях, соответствующих физиологическим значениям, вызывать активацию иммунного ответа. Мы провели независимую проверку данных об активации нейтрофилов человека с помощью мтДНК и обнаружили, что очищенная мтДНК не вызывает активации нейтро-филов. В ранее опубликованных работах, по-видимому, были использованы недостаточно очищенные препараты мтДНК, примеси в которых и вызывали подобную активацию.
Полученные результаты подтверждают ценность мтДНК как прогностического фактора смертности у пациентов с тяжелой травмой и, одновременно, поднимают вопрос о существовании дополнительных факторов, позволяющих мтДНК функционировать в качестве DAMP.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Характеристика пациентов. Работу проводили с разрешения этического комитета НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского. В работе была исследована кровь 34 пострадавших с тяжелой сочетанной травмой, которые находились на лечении в отделении реанимации и интенсивной терапии НИИ им. Н.В. Склифосовского в 2012—2014 гг., и кровь 10 здоровых добровольцев из числа врачей-ординаторов. В исследование не включали пациентов с комбинированной травмой и пациентов старше 70 лет. Тяжесть травмы оценивали по шкале тяжести повреждений — Injury Severity Score (ISS) с учетом их локализации: голова, грудь, живот, позвоночник, таз и конечности. Характеристика пострадавших представлена в табл. 1.
Пробоподготовка и выделение ДНК из плазмы крови. Через 24 ч после травмы у пострадавших отбирали 3 мл периферической венозной крови. Перед забором крови пациенты находились в состоянии покоя не менее 10 мин. Кровь, смешанную с ЭДТА (1,5 мг/мл), центрифугировали в течение 10 мин при 3000 g. Отобранную плазму дополнительно центрифугировали 10 мин при 10 000 g. Верхнюю порцию плазмы помещали в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мл и замораживали при —20° до выделения ДНК. Для контроля эффективности выделения в каждый образец плазмы объемом 0,4 мл перед про-
Таблица 1. Характеристика пострадавших с тяжелой соче-танной травмой
Характеристики Выжившие Умершие
Количество пациентов 25 9
Возраст, лет* 40 (28-50) 26 (22-59)
Мужчины 19 9
Женщины 6 0
Тяжесть повреждений 41 (34-41) 48 (43-57)
по шкале ISS, баллы*
Нозокомиальная 16 7
пневмония
Без пневмонии 9 2
* Указаны медианные значения (межквартильный интервал).
цедурой выделения вносили по 10 мкл (1,7 нг/мкл) экзогенной контрольной ДНК на основе плаз-миды pBlueScriptSKII(-) размером 8 кб. Выделение ДНК из 100 мкл плазмы крови проводили с помощью набора Quick-gDNA Blood MiniPrep («Zymo Research», США) по протоколу производителя.
ПЦР в реальном времени. Количественную ПЦР в реальном времени проводили в ампли-фикаторе iCycler («Bio-Rad», США) со смесью следующего состава: 5 мкл анализируемого образца; 10 мкл смеси Б Eva Green («Синтол», Россия); 0,5 мкл смеси каждого из специфичных праймеров (10 мкМ); 9,5 мкл деионизованной воды. Каждый образец ДНК использовали в качестве матрицы в трех идентичных ПЦР-реак-циях. Последовательности используемых прай-меров указаны в табл. 2. Специфичность праймеров к мтДНК была дополнительно подтверждена с использованием ДНК из клеток эндотелия человека EA.hy926 без мтДНК (Rho0). Эффективность подобранных пар праймеров составила 93—101%. Реакцию ПЦР проводили в следующих условиях: 94° — 5 мин; 40 циклов: 94° — 20 с, 56° - 20 с, 72° - 20 с; 72° - 5 мин. Эффективность ПЦР рассчитывали с использованием серии разведений от 1 пг/мл до 10 мкг/мл препаратов тотальной ДНК из клеток HeLa («NEB», Англия) или серии разведений, приготовленных на матрице контрольной плазмиды. Нормализацию результатов проводили с учетом амплификации контрольной последовательности вносимой плазмидной ДНК [8].
Выделение нейтрофилов. Венозную кровь здоровых доноров собирали в гепаринизирован-
Таблица 2. Характеристика праймеров
Мишень Прямой праймер (5'—3') Обратный праймер (5'—3')
яДНК человека, ретротранспозон LINE1 мтДНК человека, участок D-петли Контрольная плазмида, 8 кб ACCTGCTCCTGAATGACTA ACCCTATGTCGCAGTATCTGTC GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA GATTCTGGTATGTGGTGTCTT ATGATGTCTGTGTGGAAAGTGG ATTTGACTTTAGCCAGGTAGC
ные пробирки. Полиморфноядерные лейкоциты (нейтрофилы) были выделены с помощью седиментации с декстраном и последующим центрифугированием в градиенте Фиколл-Пак (плотность 1,077 г/мл) [1]. Полученные нейтрофилы ресуспендировали в среде RPMI-1640 («ПанЭко», Россия), содержавшей 10%-ную телячью сыворотку с низким содержанием эндотоксинов («PAA Laboratories», Германия). Жизнеспособность нейтрофилов (>98%) определяли окраской трипановым синим.
Зимография. Выделенные нейтрофилы (1 х 106 в 1 мл) обрабатывали fMLP (formyl-Met-Leu-Phe), мтДНК или MTD в конечном объеме 0,5 мл в течение 1 ч при 37° в атмосфере 5%-ного CO2. Количество секретируемой нейтрофилами желати-назы ММР9 определяли с помощью зимогра-фии в ПААГ, содержавшем 1 мг/мл желатина, по стандартной методике, описанной ранее [9].
Вестерн-блот. После инкубации с тестируемыми активаторами нейтрофилы лизировали в горячем буфере (62,5 мM Tris-HCl, pH 6,8; 2%-ный SDS; 10%-ный глицерин; 50 мM ДТТ, 0,01% бром-фенолового синего) в течение 4 мин при 95°. Белки разделяли в 12%-ном ПААГ и переносили на PVDF-мембраны («Amersham», США). Были использованы антитела к р-актину, p-38 и P-p38 («Cell Signaling», США), а также вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена («Sigma-Aldrich», США). Визуализацию проводили набором ECL («Amersham», США). Для денситометрического анализа использовали программу ImageJ 1.44p.
Выделение митохондриальных DAMP. Фракцию митохондрий выделяли из печени крыс или линии эндотелиальных клеток человека EA.hy926 с помощью дифференциального центрифугирования по протоколу, описанному ранее [1]. Для приготовления суспензии разрушенных митохондрий к фракции митохондрий добавляли протеиназный ингибитор («Amresco», США) и проводили озвучивание во льду на аппарате Branson Sonifier 150 («Branson Ultrasonics Corporation», США) при 100%-ной амплитуде, 10 раз по 30 с, с интервалом в 30 с. Суспензию разрушенных митохондрий центрифугировали
при 15 000 g (10 мин, 4°), затем при 100 000 g (1 ч, 4°). Концент
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.