РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2014, том 54, № 2, с. 162-168
== РАДИАЦИОННАЯ БИОХИМИЯ =
УДК [57+61]::539.1.04:576.3.043:576:614.875:612.1
РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ СТРУКТУРНОГО СОСТОЯНИЯ МЕМБРАН КЛЕТОК КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
© 2014 г. Е. Б. Бурлакова1, М. В. Аткарская1, Л. Д. Фаткуллина1, С. Г. Андреев1, 2
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва 2Национальный исследовательский ядерный университет МИФИ, Москва
Для выяснения возможных радиационно-индуцированных изменений структурного состояния мембран клеток крови подвергали воздействию у-излучения в интервале малых (1 — 10 сГр) и средних доз (50 сГр—2 Гр) образцы крови здорового донора. Методом ЭПР спиновых зондов измеряли микровязкость липидов мембран эритроцитов и лейкоцитов сразу после облучения. Уже при облучении в дозе 1 сГр обнаружены статистически значимые изменения выраженности спонтанного гемолиза эритроцитов и микровязкости плазматической мембраны лимфоцитов. Показана меньшая устойчивость мембран лимфоцитов по сравнению с эритроцитами в одинаковых условиях облучения.
Облучение, малые дозы, лимфоциты, эритроциты, микровязкость, мембраны, гемолиз, ЭПР-спектро-скопия, перекисное окисление липидов.
БО1: 10.7868/80869803114020040
В настоящее время постоянно ухудшающаяся экологическая ситуация ведет к увеличению частоты возникновения множества заболеваний. Это связано также с повышением радиационного фона во многих регионах из-за развития атомной индустрии, ядерной энергетики и аварийных ситуаций, что увеличивает вероятность воздействия на человека ионизирующей радиации (ИР) в малых дозах. Поэтому изучение молекулярных механизмов действия ИР в малых дозах на живой организм чрезвычайно актуально.
Активные исследования в этой области начались в России и за рубежом после аварии на Чернобыльской АЭС в 1986 г. В Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН эти работы проводятся с 1987 г., первые результаты опубликованы в статьях [1—6] и доложены на международном симпозиуме "Жизнь в атомном и химическом мире" в 1999 г. [1].
Полагают, что основной мишенью действия ИР на клетки является ДНК, а ее главным повреждением — двунитевые разрывы (ДР) ДНК, от которых в значительной мере зависит степень повреждения клетки и ее гибель. Однако в настоящее время существуют данные о том, что объектами повреждающего структуру и функции клетки действия ИР являются также и мембраны клеток, и считается вероятным, что мембраны
* Адресат для корреспонденции: 119334 Москва, ул. Косыгина, 4, ФГБУН ИБХФ РАН; тел.: (495) 939-71-79; факс: (499) 137-41-01; е-шаП: seren@sky.chph.ras.ru.
служат первичной мишенью для инициации эффекта воздействия радиации в малых дозах [7—9]. Изменения структуры мембран определяют функциональные последствия влияния радиации на организм. Показано, что физико-химическая система регуляции, связанная с клеточными мембранами, обеспечивает системы гомеостаза и адаптации к изменяющимся условиям при радиационном воздействии [10—12]. Изменение скорости перекисного окисления липидов (ПОЛ), состава липидов и структурных характеристик мембран влияет на активность мембраносвязанных белков — ферментов, каналообразующих белков, рецепторов и, следовательно, определяет функциональные последствия действия радиации на клетки, ткани и в целом на организм [11]. Увеличенное образование свободных радикалов в организме при облучении и связанное с этим усиление процессов окисления (окислительный стресс) сопровождается нарушением свойств биологических мембран и функционирования клетки в целом [13—16]. Закономерности действия радиации в малых и средних дозах на клеточные мембраны до настоящего времени не изучены в полной мере. Согласно докладу ЦЫВСЕЛЯ 1986 г. [17], дозы выше 2.0 Гр считаются большими, между 2 и 0.2 Гр — средними, а ниже 0.2 Гр (20 сГр) — малыми дозами ионизирующей радиации.
Исходя из вышесказанного, целью данной работы стало выяснение радиационно-индуциро-ванных структурных изменений в мембранах кле-
ток периферической крови человека in vitro при действии у-излучения в малых и средних дозах. Параллельно измерялись параметры окислительного стресса в эритроцитах при воздействии радиации. Были исследованы такие показатели состояния эритроцитов как резистентность мембраны, содержание продуктов, связывающихся с тиобар-битуровой кислотой (малондиальдегид — МДА), отражающее процессы ПОЛ, а также структурные характеристики (микровязкость липидов) мембран эритроцитов по вращательной подвижности специфических зондов, встраиваемых в липидный бислой мембраны на разную глубину. Следует отметить, что малые дозы излучения набирали при высокой мощности дозы облучения (уникальные возможности экспериментального канала при реакторе НИЯУ МИФИ) и малом времени воздействия радиации и низкой температуре, когда можно пренебречь процессами репарации ДНК от повреждений.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
В качестве объекта исследований были использованы лейкоциты и эритроциты периферической крови человека. Выбор клеток системы крови обусловлен их высокой чувствительностью к воздействию ионизирующей радиации и значимостью для функционирования организма в целом.
Отбор крови. В работе использовали венозную кровь одного физически здорового некурящего донора-добровольца. Отбор крови проводили в две стерильные пробирки Vacuette для коагулологии, содержащие в качестве антикоагулянта 3.2%-ный раствор цитрата натрия. Контролем для каждой облучаемой пробирки служил образец необлученной крови.
Облучение периферической крови человека проведено в интервале доз 1—200 сГр. Источником у-излучения (137Cs) служили отработанные тепловыделяющие элементы (ТВЭЛы) (реактора научно-исследовательской ядерной установки МИФИ), погруженные в колодец, по высоте которого проведена калибровка интенсивности излучения. Облучение опытных образцов проводили в следующих дозах: 1; 10 (мощность дозы 0.1 мГр/с); 50; 100 и 200 (мощность дозы 1.0 мГр/с) при комнатной температуре, после облучения образцы помещали в лед. Учитывая наличие градиента мощности дозы по высоте канала, пробирки с экспериментальными образцами облучали в горизонтальном положении (чтобы исключить градиент по высоте пробирки ~10 см).
Выделение лимфоцитов осуществляли по стандартной методике в градиентной смеси фиколл-
верографина (1.077 г/л) с последующим отмыванием клеток в PBS-буфере (Na-фосфатный буфер, рН 7.4). При выделении получали суспензию клеток в концентрации 8.6 х 106 кл/мл. Суспензию оценивали на содержание "загрязняющих" фракций лейкоцитов и эритроцитов (91% — лимфоциты, 6% — моноциты, 2% — гранулоциты, 1% — эритроциты).
Выделение эритроцитов. Эритроциты выделяли из цельной венозной цитратной крови сразу после облучения. Для этого кровь центрифугировали при 1500 об./мин 10 мин, надосадочную жидкость удаляли, полученный осадок дважды промывали физиологическим раствором. Для работы использовали 5%-ную суспензию эритроцитов в среде, содержащей 0.1 моль/л трис-HCl буфера и физиологический раствор хлорида натрия в соотношении 1 : 1. Все исследования проводили со свежими, только что отмытыми эритроцитами.
Механическую резистентность эритроцитов оценивали спектрофотометрически по выраженности гемолиза после центрифугирования суспензии эритроцитов в течение 10 мин при 1500 об./мин [18].
Содержание продуктов ПОЛ, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (малоновый диальде-гид — МДА), определяли по общепринятым методикам [18]. Измерения проводили при длине волны X = 540 нм на спектрофотометре СФ-2000 ("ЗАО ОКБ Спектр", Россия). На каждое измерение брали три параллельных пробы.
Микровязкость липидов мембран оценивали методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) согласно работе [19] по времени вращательной корреляции включенных в мембрану спиновых зондов: 2,2,6,6-тетраметил-4-каприлоил-оксипиперидин-1-оксила (зонд 1) и 5,6-бензо-2,2,6,6-тетраметил-1,2,3,4-тетрагид-ро-у-карболин-3-оксила (зонд 2), которые различаются по своим гидрофобным свойствам. Известно, что зонд 1 преимущественно локализуется в поверхностном слое липидной мембраны на расстоянии 2—4 Ä от поверхности, а зонд 2 — в зоне прибелковых липидов на глубине 6-8 Ä от поверхности [20]. Зонды вводили в 5%-ную суспензию мембран эритроцитов в виде спиртового раствора за 30 мин до измерения образцов на ЭПР-спектрометре ER-200D SRC фирмы "Braker" (Германия). По полученным спектрам ЭПР, используя формулы для быстро-вращающихся зондов, рассчитывали время вращательной корреляции зонда тс, которое представляет собой время переориентации зонда на угол ~я/2 и характеризует микровязкость липидов в мембране [21].
Гемолиз, мг НЬ/мл эритроцитов 26
24 22 20 18 16 14 12
10
50 100
150 200 Доза, сГр
Рис. 1. Дозовая зависимость степени гемолиза эритроцитов периферической крови человека при действии ионизирующей радиации.
Время вращательной корреляции зонда, тс X 10-10 , с 1.2
1.1
1.0
0.9 0.8 0.7 0.6
^--*—Н—}-}
_|_I_I_//_|_I_I_|_
5
зонд 1 зонд 2
10 50 100 150 200 Доза, сГр
Рис. 3. Дозовая зависимость микровязкости липидов мембран эритроцитов периферической крови человека при действии ионизирующей радиации.
0
5
0
Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакета прикладных статистических программ 8ТАТ18Т1-КА 6.0. Достоверность различий между группами определяли с помощью непараметрических критериев Вилкоксона—Манна—Уитни. Статистически значимыми считали различия прир < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Проведенное исследование показывает, что статистически значимые изменения в структуре мембран эритроцитов происходят при облучении
МДА х 10 2 мкмоль/мл эритроцитов 6
10
50 100
150 200 Доза, сГр
Рис. 2. Дозовая зависимость содержания МДА в эритроцитах периферической крови человека при действии ионизирующей радиации.
образцов крови в дозе 1 сГр. Количество МДА в эритроцитах снижается по отношению к контролю на 11% и далее с увеличением дозы облучения практически не изменяется, оставаясь на несколько пониженном уровне вплоть до окончания эксперимента (рис. 1). При изучении гемолиза эритроцитов обнаружено увеличение этого показат
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.