Радиационные повреждения в криомикроскопии: всегда ли во вред?
Е.В.Печникова, М.П.Кирпичников, О.С.Соколова
В попытках обойти дифракционный предел, связывающий максимально возможное разрешение микроскопа с длиной волны излучения, специалисты по оптической микроскопии дошли до столь изощренных методов, что недавно удостоились Нобелевской премии. Более естественный путь повышения разрешения выбрала микроскопия электронная: максимально снизить саму длину волны (использовать электроны с короткой длиной волны, т.е. с высокой энергией). При формировании изображений с помощью электронов дифракционный предел может быть смещен в субангстремную область. Разумеется, длина волны — не единственный фактор, определяющий достигаемое разрешение: на него влияют абберации линз микроскопа, некогерентность пучка частиц, механическая нестабильность колонны микроскопа и окружающего его пространства, например, вибрации, сильные электромагнитные поля, скачки температуры. Все это приводит к уменьшению способности микроскопа передавать информацию о мелких деталях структуры объекта. Но у электронной микроскопии есть и более существенный недостаток: при облучении вещества высокоэнергичными электронами может произойти его радиаци-
© Печникова Е.В., Кирпичников М.П.,
Соколова О.С., 2015
Евгения Викторовна Печникова, младший научный сотрудник лаборатории электронной микроскопии Института кристаллографии имА.ВШубникова РАН. Занимается трехмерной реконструкцией белков, молекулярным моделированием, изучает структуру вирусов растений.
Михаил Петрович Кирпичников, академик, доктор биологических наук, декан биологического факультета МГУ им.М.ВЛо-моносова, заведующий кафедрой биоинженерии этого факультета. Область научных интересов — генная инженерия и биоинженерия.
Ольга Сергеевна Соколова, доктор биологических наук, доцент той же кафедры. Специалист в области структурной биологии и электронной криомикроскопии.
онное повреждение. Особенно критично оно для биологических образцов, когда сохранность объекта изучения становится решающим фактором. В результате повреждения информация о тонких деталях объекта исследования оказывается утерянной.
Потери и борьба с ними
Характер взаимодействия электронов с веществом зависит от их энергии и состава образца. Одни электроны проходят через образец без каких-либо взаимодействий, другие отклоняются электростатическим полем атомного ядра, экранированным электронами атомов, а некоторые могут сталкиваться с ядрами, рассеиваясь под большим углом или даже отражаясь назад. Какие-то из взаимодействующих частиц меняют свои траектории без потери энергии, а какие-то — передают часть своей энергии образцу (рис.1).
При упругих взаимодействиях кинетическая энергия падающего пучка электронов остается неизменной. Лишь незначительная часть подобных столкновений может повреждать образец, выбивая (knock-on) атомы со своих мест. Большинство лучевых повреждений вызываются неупругими соударениями, когда падающий пучок передает часть своей энергии образцу. Вероятность и тех и других взаимодействий (несущих информацию упругих и повреждающих неупругих) обратно пропорциональна величине ускоряющего напряжения катода [2]. Поэтому, если мы увеличиваем его, стремясь к все более высокому разрешению, нам придется (чтобы сохранить информативность) делать большим и время выдержки. А это означает, что и число радиационных дефектов вырастет... Есть ли выход из такой, казалось бы, безнадежной ситуации?
Чтобы ответить на этот вопрос, рассмотрим причины и следствия электронно-лучевого повреждения.
Переданная электронами энергия может ионизировать атомы в образце, вызывать рентгеновское излучение, инициировать перегруппировку химических связей. В итоге изменяется структура
Рис.1. Траектории электронов, взаимодействующих с веществом образца [1].
образца, и, следовательно, получаемые данные не будут адекватно отображать его исходное строение. Используемые в микроскопии энергии электронов в сотни килоэлектронвольт значительно превышают энергии ковалентных связей (порядка нескольких электронвольт). Наибольшие повреждения наносятся образцу, когда падающие электроны теряют от = 5 до =100 эВ своей энергии (в среднем =20 эВ) [3]. Эти потери идут по большей части на возбуждение валентных электронов (которые и образуют ковалентные связи), на разрыв связей, на эмиссию вторичных электронов, а в биологических объектах — на появление свободных радикалов. Этот процесс называется первичным повреждением. Свободные радикалы, в свою очередь, запускают каскад реакций, именуемый вторичным повреждением.
Для минимизации повреждений и искажения результатов в электронной микроскопии есть несколько подходов.
Во-первых, уменьшают экспозицию и время облучения образца. Типичные значения электронной экспозиции, выбираемые для биологических объектов, составляют от 1 до 20 e/A2. Хотя некоторые биологические образцы и могут выдерживать воздействие в 100—500 e/A2 (в зависимости от химического состава и температуры), детали, требующие высокого разрешения, претерпевают изменения уже при экспозициях от 10 e/A2 и менее. Таким образом, радиационное повреждение определяет условия эксперимента и ограничивает разрешение регистрируемых биологических структур. Во-вторых, для снижения повреждений во время выбора зоны, выравнивания и фокусировки пучка электронов применяются специальные системы «низкой дозы», чтобы блокировать луч до последнего шага — получения изображения. Однако малые выдержки, как уже пояснялось, приводят к потере разрешения, шумным изображениям и, как следствие, к недостатку высокодетализированных данных. Это, в свою очередь, усложняет последующий процесс обработки изображений для определения трехмерной структуры объекта. Для таких коротких выдержек становится критически важной способность детектора воспринимать каждый попавший на него электрон.
Заморозить, чтобы защитить
В целях сохранения структуры образца в 80-х годах XX в. была впервые применена криомикроско-пия, позволяющая изучать биообъекты путем помещения их в моментально замороженный слой воды — «аморфный лед» (рис.2). Для этого используют специальные сетки, которые покрыты слоем углерода с маленькими отверстиями. На такую сетку наносят суспензию с образцом, а избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой. В итоге тонкий слой жидкости (до 500 мкм), содержащий
а
-3 мм -
-60 мкм -
Ь«—1 мкм -
-1 мкм -
Рис.2. Схематическое изображение подготовки образца для изучения в криомикроскопе. Медная сетка, на которую нанесен слой углерода с отверстиями (а). Ячейка сетки с большим увеличением (б). Слой углерода, содержащий отверстие, заполненное аморфным льдом (в). Поперечный срез отверстия в углеродном слое (г): 1 — слой аморфного льда, 2 — изучаемые частицы в окружении аморфного льда [4].
объект исследования, сохраняется только в отверстиях углеродной пленки (рис.2,г,д). Затем сетку опускают в жидкий этан или пропан для быстрой заморозки. Скорость заморозки должна быть высокой, чтобы молекулы воды в суспензии не успели перегруппироваться и образовать кристаллический лед. Кристаллы льда, поглощая электроны, мешают идентифицировать образец, а кроме того, разрушают в ходе своего роста мембраны клеток и макромолекулы.
Разрыв химических связей происходит при любых температурах, следовательно, охлаждение не влияет на первичное повреждение образца. Однако холод замедляет движение молекул, т.е. тормозит вторичное повреждение [5]. Низкие температуры позволяют улучшить разрешение в диапазоне от 20 до 60 А, однако для более высокого разрешения это правило не действует. Как показывает практика, использовать в эксперименте температуры ниже температуры жидкого азота не имеет смысла, так как в этом случае меняется качество льда и быстро падает контраст [6].
К сожалению, в приготовленных указанным способом препаратах неизбежно третичное повреждение белков — из-за образования газовых пузырей (рис.3). Последние порождаются появляющимся в замороженном образце газообразным водородом [7]. Сначала под действием пучка электронов происходит радиолиз воды: Н2О ^ Н + ОН-. В толще льда эти радикалы объединяются обратно в Н2О, однако вблизи белковых молекул они вступают в реакцию с атомами водорода из этих органических соедине-
Рис.3. Электронно-лучевое повреждение образца в криомикроскопии. Бактериофаги EL, замороженные в аморфном льде: без повреждений (левый) и идентичный бактериофаг после облучения высокой дозой электронов (правый). Заметны пузыри газообразного водорода (стрелки).
ний: OH- + R-H ^ RO- + H2. Пузыри образуются предпочтительнее близ поверхности молекулы, соприкасающейся со льдом, нежели внутри белка [8]. Газ выделяется в таких количествах, что давление внутри пузыря может достигать тысячи атмосфер [7]!
С развитием детекторов электронов и разработкой устройств с возможностью прямой регистрации частиц (Direct detectors) появился новый способ минимизировать электронно-лучевые повреждения образца. Устройства с прямой регистрацией электронов позволяют получить за секундную выдержку от 16 до 400 кадров. Благодаря специальной процедуре обработки можно выровнять и сложить изображения одной и той же белковой частицы со всех полученных кадров (рис.4). Таким образом компенсируется движение частиц во льду, происходящее за время длительной выдержки. С помощью данной методики получения изображений можно корректировать не только вызываемый пучком электронов сдвиг частиц, но и эффекты лучевого повреждения. Для этого из всего набора полученных за время выдержки изображений берут для дальнейших расчетов лишь несколько первых, суммарное время экспозиции которых мало. Комбинация этих двух подходов позволила в последние два-три года существенно улучшить разрешение получаемых трехмерных реконструкций — до 3—4 А [10].
Опыт показывает: наиболее чувствительны к лучевому повреждению остатки цистеина, аспартата и глютамата (рис.5). Некоторые из дисульфидных
' -;."'." Щ
Рис.4. Криоизображения вирусов с высокой четкостью, полученные благодаря коррекции смещения частиц. Суммарное изображение 60 последовательных кадров с ротавирусом
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.