УДК 577.171
РАДИОЛИГАНДНЫЙ МЕТОД ОЦЕНКИ РЕЦЕПТОРНОЙ АКТИВНОСТИ Р-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ Т-ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА
© 2015 г. О. Ю. Агапова*, Ю. С. Скоблов**, #, К. А. Зыков*, А. В. Рвачева*, В. Б. Бейлина*, В. П. Масенко***, И. Е. Чазова***
*Лаборатория пульмонологии НИМСИМосковского государственного медико-стоматологического университета им. А.И. Евдокимова, 127473, Москва, ул. Делегатская, 20/1 **ФГБУНИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
117997, Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 ***НИИклинической кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУРКНПКМинздрава России, 121552, Москва, ул. 3-я Черепковская, 15 А Поступила в редакцию 19.12.2014 г. Принята к печати 18.03.2015 г.
На основе радиолигандного метода предложен способ количественной оценки рецепторной активности Р-адренорецепторов на поверхности Т-лимфоцитов человека. Подобраны условия, при которых с помощью [1251]цианопиндолола можно достоверно выявлять специфическое связывание лиганда р2-адре-норецептором на уровне 0.5 фмоль на 1 млн клеток. На примере Т-лимфоцитов человека показана реальная возможность постановки этого анализа для клинических исследований.
Ключевые слова: в-адренорецепторы [1251]цианопиндолол, радиолигандный анализ.
DOI: 10.7868/S0132342315050024
ВВЕДЕНИЕ
В научной медицинской практике широкое распространение получили исследования, посвященные изменениям рецепторных взаимодействий при различных заболеваниях, в том числе на фоне применения лекарственных препаратов. В структуре неинфекционных патологий наибольший вес имеют сердечно-сосудистая и бронхо-ле-гочная патологии. Заболевания сердечно-сосудистой системы находятся на первом месте среди причин смертности как в России, так и в других странах мира [1]. При бронхолегочной патологии особо актуальными являются бронхообструктив-ные заболевания [2, 3]. Пациентам, имеющим данные заболевания, часто необходимо назначение препаратов, воздействующих на р-адренорецепто-ры. В основе лекарственной терапии при заболеваниях легких лежат специфические лиганды адре-норецепторов, являющиеся р-адреномиметиками ф-агонистами), а при сердечно-сосудистых заболеваниях применяются лиганды, являющиеся р-адре-ноблокаторами. При воздействии на организм соответствующих препаратов (адреномиметиков
Список сокращений: PBS — 5 мМ калий-фосфатный буфер с 0.14 М NaCl, рН 7.0, BSA — бычий сывороточный альбумин, ПКА — протеинкиназа А.
#Автор для переписки (тел.: +7 (495) 336-26-41, e-mail: sur@ibch.ru).
или адреноблокаторов), происходят изменения экспрессии и аффинности адренорецепторов. Длительное применение этих препаратов может снизить эффективность назначенной терапии и в ряде случаев приводит развитию побочных эффектов.
Для определения состояния адренорецептор-ного аппарата в последние десятилетия разработан ряд прямых и косвенных методов. Прямые методы состоят в оценке аффинности рецепторов к специфическим лигандам, а также в оценке экспрессии рецепторов. К косвенным методам относят определения изменений состояния вторичных мессенджеров: уровня циклического АМР (сАМР), активности протеинкиназы А (ПКА). Одним из способов оценки адренорецепторного аппарата лимфоцитов является определение выраженности адренозависимых внутриклеточных биохимических процессов после воздействия аго-ниста на гомогенную популяцию клеток [4]. Исследование влияния вторичных мессенджеров (cAMP, ПКА) позволяет опосредовано оценивать экспрессию p-адренорецепторов [5—7]. Однако, такой подход, во-первых, дает лишь косвенную информацию о рецепторной активности лимфоцитов, а, во-вторых, требует значительного количества крови для анализа.
Более высокую чувствительность демонстрируют методы полимеразной цепной реакции в ре-
альном времени (RT PCR) и вестерн-блот-анализ с антителами против ß-адренорецепторов. Количество материала, необходимое для таких анализов, существенно меньше. К сожалению, эти методы дают информацию только об уровне экспрессии генов ß-адренорецепторов в исследуемых клетках: RT PCR — об уровне транскрипции, а ве-стерн-блот — об уровне трансляции [8]. Собственно рецепторную активность ß-адренорецепторов, т.е. связывание ими специфических лигандов, этими методами измерять невозможно. В настоящее время исследования аффинности и экспрессии ß-адренорецепторов проводят в основном на моделях животных in vivo и на выделенных клеточных линиях in vitro [6, 7, 9—11].
Классический радиолигандный метод анализа активности ß-адренорецепторов лимфоцитов состоит в определении специфического связывания ими специфических лигандов, меченных радиоактивным 125I или 3H. Неспецифическое связывание определяется при добавлении избытка немеченого лиганда. Специфическое связывание рассчитывается по разности общего и неспецифического связывания, плотность рецепторов и константа диссоциации определяются в координатах Скэтчарда, с использованием коэффициента линейной регрессии. По кривым вытеснения нерадиоактивным лигандом специфического радиоактивного лиганда рассчитывают константу диссоциации комплекса рецептора с лигандом по формуле Чен-га—Пруссова [13, 14]. Однако описанный радиоли-гандный метод определения количества и аффинности ß-адренорецепторов является трудоемким, дорогостоящим и требует забора большого количества крови, особенно при применении в исследованиях влияния препаратов, воздействующих на ß-адренорецепторы. Конечно, этот вариант анализа мало применим в условиях реальной клинической практики.
В настоящей работе мы представляем данные по модификации радиолигандного метода определения рецепторной активности ß-адренорецеп-торов Т-лимфоцитов человека с использованием [1251]цианопиндолола. Мы считаем, что с помощью такой модификации возможно изучение характеристик ß-адренорецепторов не только на моделях (клеточных линиях или лабораторных животных), но и в практической медицине.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Адренорецепторы, по своей структуре, относятся к группе рецепторов, соединенных с гуанин-нуклеотидсвязывающими белками (G-белок). Анатомически ß-адренорецепторы подразделяются на несколько подтипов, максимальное количество ß1-адренорецепторов находится в правом предсердии, ß2 — в легких, ß3 — в жировой ткани [15, 16].
При изучении состояния рецепторной активности оцениваются аффинность (сродство) и экспрессия (количество) рецепторов.
Взаимодействие лиганд—рецептор зависит от типа лиганда (агонист или обратный агонист) и проявляется в изменении клеточной активности. Агонисты, связываясь с рецептором, активируют G-белок и увеличивают внутриклеточное содержание циклического аденозинмонофосфата (сАМР). Данные изменения в клетке приводят не только к возникновению клинического эффекта, одновременно также происходит изменение активности рецептора [17].
Зачастую назначение агонистов в качестве лекарственного средства приводит к снижению чувствительности к лиганду и десенситизации рецепторов [18—20], что, в ряде случаев, вызывает изменение клинического течения заболевания [21]. Применение антагонистов напротив, приводит к повышению плотности р-адренорецепторов [22] на поверхности клеток млекопитающих и может повлиять на их аффинность [12]. Необходимо отметить, что изменение рецепторной активности наблюдается не только под воздействием фармакологических препаратов; сами заболевания сердечно-сосудистой и бронхо-легочной систем сопровождаются исходно измененным фоном активности рецепторов. У пациентов с наличием желудочковой экстрасистолии количество р2-ад-ренорецепторов на лимфоцитах периферической крови статистически выше, чем у группы нормы [23]. У пациентов с артериальной гипертензией экспрессия в2-адренорецепторов оказалась также выше нормы и коррелировала с тяжестью заболевания. При этом наличие у пациентов сердечной недостаточности приводило к снижению показателя максимального связывания р2-адренорецеп-торов [24]. При обследовании больных с обструк-тивной патологией легких отмечаются противоречивые данные: одни источники показывают исходно низкую плотность р2-рецепторов на поверхности клеток крови, другие не отмечают связи изменения плотности рецепторов на поверхности клеток крови с наличием бронхиальной астмы [25].
Для определения количества и аффинности р-адренорецепторов с помощью радиолигандного анализа обычно используют [1251]цианопиндолол, а для селективного анализа р-адренорецепторов используют [3Н]CGP12177 (химическое наименование: 4- [3- [(1, 1-диметилэтил)амино] -2-гидрок-сипропокси]-1,3-дигидро-2#-бензимидазол-2-он гидрохлорид, специфический лиганд р1-адрено-рецептора) [26]. При этом следует отметить, что специфическая активность [1251]цианопиндолола составляет около 2000 Ки/ммоль в то время как специфическая активность [3Н]CGP12177, как правило, не превышает 30—50 Ки/ммоль.
120
ce g
s S
я s
I-1 о
^ Й
^ч га
H О
О
и
« з
m «
m О
80
40
••---
2
10 30 100 300 10 [Лиганд], нм
125
Рис. 1. Связывание [ ^цианопиндолола лимфоцитами в присутствии бета-активных лигандов: Pj-ли-ганда CGP-20712 (1) и Р2-лиганда ICI 118551 (2). Каждое измерение связывания [ ^цианопиндолола с Т-лимфоцитами проводили в 3 независимых параллелях. Среднее отклонение не превышало 10%.
Основной целью настоящей работы является модификация радиолигандного анализа для количественной оценки активности р-адренорецепто-ров клеток крови человека с возможным применением для клинических исследований. Меченные тритием лиганды дают примерно в 100 раз более низкую чувствительность анализа — по сравнению с [1251]цианопиндололом. [1251]Цианопиндолол позволяет проводить анализ с чувствительностью до 0.2—0.4 фмоль (0.2—0.4 х 10-15 моль) в образце.
Специфическое связывание с клетками мы оценивали как разность между связыванием [1251]цианопиндолола в присутствии 1.7 мкМ нерадиоактивного ("холодного") цианопиндолола и в его отсутствие. Эта разность является суммарной специфической активностью рецепторов, связывающих цианопиндолол, и обычно используется как характеристика специфичности анализа [27]. В качестве модели для отработки методики мы использовали суммарные лимфоциты человека, причем клетки представляли собой объединен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.