БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 7, с. 1088 - 1098
УДК 577.114
РАМНОГАЛАКТУРОНАН I ЖЕЛАТИНОЗНЫХ ВОЛОКОН ЛЬНА ФОРМИРУЕТ ГЕЛЬ, ОБЛАДАЮЩИЙ ГИПЕРЭЛАСТИЧНЫМИ СВОЙСТВАМИ
© 2015 П.В. Микшина*, А.А. Петрова, Д.А. Файзуллин, Ю.Ф. Зуев, Т.А. Горшкова
Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН, 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31; факс: +7(843)292-7347, электронная почта:p.mikshina@gmail.com
Поступила в редакцию 08.02.15 После доработки 27.02.15
Рамногалактуронаны I — сложные, крайне вариабельные по структуре и свойствам пектиновые полисахариды, широко представленные в различных источниках. Сложность строения и разнообразие рамногалак-туронанов I служат причиной ограниченных сведений о свойствах и надмолекулярной организации этих полисахаридов, в т.ч. о взаимосвязи между этими параметрами и функцией рамногалактуронанов I в растительной клетке. В работе на примере рамногалактуронана I желатинозных волокон льна впервые установлена способность этих пектиновых полисахаридов образовывать при физиологических концентрациях гидрогели, обладающие гипер эластичными свойствами. По данным ИК-спектроскопии в гелеобразующем рамногалактуронане I клеточной стенки волокон льна присутствуют молекулы воды, более прочно удерживаемые полисахаридом по сравнению с не формирующим гель рамногалактуронаном I первичной клеточной стенки картофеля. При возрастании силы связывания воды рамногалактуронаном I наблюдается повышение модуля упругости и понижение коэффициента Пуассона геля, формируемого этим полисахаридом. Модель захвата гиперэластичного рамногалактуронана I латерально взаимодействующими микрофибриллами целлюлозы, построенная с применением метода конечных элементов, подтвердила пригодность геля из рамногалактуронана I с установленными свойствами для функционирования в условиях желатинозной клеточной стенки, что позволяет рассматривать этот ткане- и стадияспецифичный пектиновый полисахарид как важный фактор в создании контрактильности желатинозных волокон.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: желатинозные волокна, полисахариды, рамногалактуронан I, сорбция воды, гель, упруго-пластические свойства.
Растительная клеточная стенка служит источником необозримого множества углеводных структур, построенных главным образом на базе десяти типов полисахаридных остовов. Разнообразие полисахаридов клеточной стенки, в т.ч. имеющих одинаковый тип остова, сопряжено, по всей видимости, с их «функциональной пригодностью» [1]. Однако критерии, определяющие «функциональную пригодность» полисахаридов клеточной стенки, до сих пор не определены. Одним из таких критериев может служить способность к формированию надмолекулярных структур, характеризующихся определен-
Принятые сокращения: ЯвГ — рамногалактуронан I волокон льна до встраивания в клеточную стенку, Явй^ — рамногалактуронан I клеточной стенки волокон льна, Явр — рамногалактуронан I первичной клеточной стенки картофеля, ОВ — относительная влажность.
* Адресат для корреспонденции.
ными физико-химическими и механическими свойствами. Результатом такой способности служит, в частности, образование отдельными полисахаридами гелей различного типа. Способ гелеобразования и свойства формируемого геля при этом могут отличаться не только для структурно-отдаленных полисахаридов, но даже в пределах полисахаридов, построенных на основе одного типа остова [2—5].
Среди наиболее охарактеризованных гелеоб-разующих полисахаридов высших растений ключевое место занимают пектины, включающие полигалактуроновую кислоту и рамнога-лактуронаны I и II. Способность пектинов к ге-леобразованию связывают главным образом с наличием в их структуре высоко- и низкометок-силированной полигалактуроновой кислоты [6—8]. Принято считать, что рамногалактурона-ны высших растений при отсутствии в структуре фрагментов гомогалактуронана гелей не образу-
ют [9], хотя для ряда из этих полисахаридов была продемонстрирована способность к агрегированию с участием модифицирующих групп и/или нейтральных боковых цепей [10—13]. Необычные ассоциаты пектиновых молекул, не содержащих участков полигалактуронана, были охарактеризованы для ткане- и стадияспеци-фичных рамногалактуронанов I волокон льна, присутствующих на стадии формирования третичных клеточных стенок. Такие клеточные стенки характерны для многих растительных волокон и названы, благодаря гелеподобному виду, желатинозными (от «gelatinous»). Особенность пространственной организации ассоциа-тов рамногалактуронана I клеточной стенки волокон льна состоит в том, что заряженный остов полисахарида, построенный из чередующихся димеров [^4)-a-D-GalpA-(1^2)-a-L-RhaP(1^], расположен на поверхности, а нейтральные га-лактановые цепи, взаимодействуя друг с другом, формируют ядро и удерживают составляющие ассоциат молекулы [13]. В желатинозных слоях клеточной стенки ассоциаты такого типа оказываются «запечатанными» между латерально взаимодействующими микрофибриллами целлюлозы. Это служит причиной эффективного натяжения микрофибрилл и, как следствие, возникновения характерных для волокон контрак-тильных свойств [14—18]. Локализация и функционирование рамногалактуронана I в условиях давления, возникающего при взаимодействии микрофибрилл целлюлозы, предполагает наличие у этого полисахарида определенных упруго-пластических свойств. Благодаря особому типу секреции содержимого везикул Гольджи при формировании третичной клеточной стенки [19] рамногалактуронан I может быть выделен и до встраивания в клеточную стенку [20].
Цель этой работы состоит в установлении физико-химических и механических особенностей тканеспецифичного рамногалактурона-на I, определяющих «функциональную пригодность» этого полисахарида как элемента третичной клеточной стенки желатинозных волокон. Для этого будет проведено сопоставление свойств этого полисахарида и высокомолекулярного рамногалактуронана I, выделенного до встраивания в клеточную стенку желатинозных волокон льна, а также рамногалактуронана I тонкой первичной клеточной стенки картофеля, не способного к формированию ассоциатов особого типа. Будет охарактеризована способность исследуемых рамногалактуронанов I к ге-леобразованию, включая особенности сорбцион-ных свойств этих полисахаридов по отношению к воде как ключевому фактору в образовании характерных для полисахаридов гидрогелей.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Растительный материал. Объектом исследований служили растения льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) сорта Могилевский из коллекции ВНИИ льна (г. Торжок). Растения выращивали в условиях вегетационного опыта в ящиках со слоем почвы 50 см на открытом воздухе при естественном освещении и ежедневном поливе. Для выделения рамногалактуронана I до встраивания в клеточную стенку использовали волокнистую часть отрезков стебля (10 см) ниже точки слома [21] растений на стадии быстрого роста (40 дней после посева). Для выделения рам-ногалактуронана I из клеточной стенки использовали зрелые изолированные волокна (100 дней после посева).
Выделение и очистка рамногалактуронанов I. Рамногалактуронан I волокон льна до встраивания в клеточную стенку (RGf) выделяли как высокомолекулярный полимер, попадающий в су-пернатант при гомогенизации ткани в буфере (10 мМ NaOAc, pH 5,0, 10 мл на 1 г ткани). Содержащиеся в осветленном гомогенате полимеры фильтровали и осаждали этанолом до конечной концентрации 80%, осадок высушивали, перерастворяли и хроматографировали на колонке с сефарозой CL-4B (12 х 400 мм, «Pharmacia», Швеция). Элюент — 0,01 M пиридин/уксусная кислота, pH 4,5, скорость потока — 0,25 мл/мин, объем собираемых фракций — 1,0 мл. Для анализа отбирали фракции, соответствующие 700—2000 кДа [20, 22]. Содержание углеводов в каждой фракции определяли фенол-сернокислотным методом [23]. Для калибровки колонки использовали пуллуланы с Mw 1660, 380, 100 и 48 кДа («Showa Denko», Япония) и низким индексом полидисперсности (1,09—1,19).
Рамногалактуронан I желатинозной клеточной стенки (RGfcw) выделяли из предварительно отмытых 1%-ным оксалатом аммония и 4 M KOH волокон льна согласно методике, разработанной Гурьяновым с соавт. [22]. Для полного разрушения микрофибрилл целлюлозы использовали 8%-ный раствор LiCl («Merck», Германия) в обезвоженном на молекулярных ситах (4 A, «Sigma», Германия) ^^диметилацетамиде («AppliChem», Германия) и целлюлазу (Cellusoft-L, «Novo Nordisk Bioindustrrie S.A.», Франция; 750 EGU/G). Очистку рамногалактуронана I, составляющего основной объем полученной фракции полимеров, проводили с помощью гель-фильтрации на колонке с cефарозой CL-4B (12 х 400 мм, «Pharmacia», Швеция) при тех же условиях, что использовались для разделения буфероэкстраги-руемых полимеров. Для анализа отбирали фракции, соответствующие 100—400 кДа [22, 24].
Очистку коммерческого препарата рамнога-лактуронана I первичной клеточной стенки картофеля (RGp) («Megazyme», Ирландия) от низкомолекулярных примесей проводили на колонке с сефадексом G-25 («Pharmacia», Швеция).
Получение гелей из рамногалактуронанов I.
Для получения гелей из рамногалактуронанов I волокон льна и картофеля было использовано три подхода [25]:
1) высушенный препарат полисахарида насыщали водой (соотношение полисахарид : вода 4 : 1 с последующим увеличением доли воды в образце);
2) раствор полисахарида нагревали на водяной бане при температуре 90° в течение 5 мин и охлаждали при комнатной температуре;
3) раствор полисахарида выдерживали в микроволновой печи при мощности 584 Вт в течение 1 мин, затем заливали в блистеры с ячейками диаметром 10,3 мм и охлаждали при комнатной температуре до застывания.
Эксперименты по одноосному сжатию. Для определения модуля Юнга и коэффициента Пуассона полученные гели подвергали одноосному сжатию (рис. 1). Измерения проводили с по-
мощью микрометра с цифровым отсчетным устройством (МКЦ-25-0.001, «Челябинский инструментальный завод», Россия), оценивая изменение высоты геля после приложения давления. В качестве источника давления использовали грузы различной массы (1, 2, 5, 10, 20, 100 и 200 г). Перед измерением систему выдерживали в течение 30 с в свободном от давления состоянии (восстановление
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.