ГЕНЕТИКА, 2008, том 44, № 3, с. 417-422
КРАТКИЕ ^^^^^^^^^^^^^^ СООБЩЕНИЯ
УДК 575.113:582.547.2
RAPD-АНАЛИЗ ГЕНОМНОГО ПОЛИМОРФИЗМА У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМЕЙСТВА Lemnaceae (РЯСКОВЫЕ)
© 2008 г. Е. В. Мартиросян, Н. Н. Рыжова, К. Г. Скрябин, Е. 3. Кочиева
Центр "Биоинженерия" Российской академии наук, Москва 117312; e-mail: ekochieva@yandex.ru
Поступила в редакцию 17.04.2007 г.
Впервые проведен мультилокусный RAPD-анализ межвидового, внутривидового и межродового полиморфизма ядерного генома у представителей Lemnaceae, произрастающих на территории России. Было проанализировано 75 образцов трех родов (Lemna, Spirodela, Landoltia), восьми видов (L. minor, L. gibba, L. turionifera, L. japónica, L. trisulca, L. aequinoctialis, S. polyrhiza, L. punctata) семейства Lemnaceae. Наибольший уровень вариабельности был выявлен у представителей вида L. minor (0.03-0.20), виды L. trisulca и S. polyrhiza характеризовались значениями генетических расстояний 0.01-0.18 и 0.03-0.16 соответственно. Наименьшие значения генетических расстояний были показаны для вида L. turionifera (0.01-0.11). На дендрограмме, построенной по RAPD-данным, наиболее генетически отдаленным видом рода Lemna является L. aequinoctialis. Образцы видов L. turionifera и L. japonica, а также L. minor и L. gibba не образовывали отдельных клад, а формировали объединенные кластеры L. japonica/L. turionifera и L. minor/L. gibba. Представители родов Spirodela и Landoltia формировали отдельные кластеры, объединенные в одну группу.
Семейство Рясковые объединяет самые мелкие цветковые растения, вегетативные и генеративные органы которых отличаются значительной редукцией. Крайне небольшие размеры и отсутствие четко дифференцированных вегетативных органов ограничивают число таксоно-специфических признаков. В связи с этим данное семейство относят к одному из самых сложных в систематике цветковых растений [1]. Существующие классификации по-разному трактуют видовой и родовой состав Lemnaceae [2]. Согласно одной из последних, данное семейство включает пять родов - Lemna L., Spirodela Schleiden, Landoltia Les & Crawford, Wolffiella Hegelmaier, Wolffia Horkel ex Schleiden [3]. В настоящее время существует ряд проблем по определению видовых и даже родовых границ внутри Lemnaceae, что подтверждается недавним выделением из состава рода Spirodela вида S. punctata в отдельный род Landoltia [3].
Значительная редукция вегетативных органов, характерная для представителей данного семейства, затрудняет также оценку потенциального генетического разнообразия и реконструкцию филогенетических отношений внутри семейства на основе только одних морфофизиологических признаков. Особенно актуальным становится использование молекулярных методов анализа генома, включая исследования нуклеотидного полиморфизма геномных и пластомных последовательностей.
В настоящее время для определения уровней геномного полиморфизма, установления таксономического статуса отдельных образцов и для выявления филогенетических отношений различных таксонов наиболее часто применяют такие молекулярные методы, как RAPD и AFLP [4].
На сегодняшний момент число исследований биоразнообразия Lemnaceae с помощью молекулярных методов невелико. Ранее был проведен анализ вариабельности последовательностей хлоропласт-ной ДНК, на основе полученных данных выявлены филогенетические отношения Lemnaceae [2]. Однако при этом не оценивался внутривидовой полиморфизм, так как каждый вид был представлен только одним образцом. Также до настоящего времени не проводилось анализа ядерного генома и оценки полиморфизма Lemnaceae на разных таксономических уровнях, включая внутривидовой.
Цель данной работы - с помощью мультило-кусного RAPD-анализа установить генетические различия исследованных образцов ряски и на их основе определить уровни межвидовой, внутривидовой и межродовой изменчивости ядерного генома представителей видов и родов Lemnaceae, произрастающих на территории России.
Ранее нами была составлена коллекция из 256 образцов Lemnaceae, собранных из 119 мест произрастания. Чтобы максимально охватить ареал каждого вида, из коллекции были отобраны 75 образцов, которые, согласно морфологическим данным и географической приуроченности, а также предварительно полученным молекулярным данным (Рыжова Н.Н, неопубликованные данные), наиболее полно отражают геномную вариабельность и биоразнообразие восьми видов трех родов Lemnaceae. Данный набор представлен: L. minor (наиболее распространенный вид на территории России) - 24 образца, L. gibba - 6, L. turionifera - 5, L. japonica - 3, L. trisulca - 16, L. aequinoctialis - 3, S. polyrhiza - 16, L. punctata - 2 (табл. 1). В качестве внешней группы был взят яв-
Таблица 1. Список образцов Lemnaceae, взятых в анализ
Вид/образец Место сбора образца Вид/образец Место сбора образца
Род Lemna Род Lemna
L. minor 4.4 г. Серпухов, Московская обл. L. trisulca 1 г. Москва, Битцевский парк
L. minor 5.6 г. Екатеринбург L. trisulca 2 г. Волхов, Ленинградская обл.
L. minor 7.1 д. Тюнзыры, Чувашия L. trisulca 3 г. Сходня, Московская обл.
L. minor 7.4 д. Тюнзыры, Чувашия L. trisulca 4.1 г. Москва
L. minor 8.4 Чувашия, торфяник L. trisulca 6.6 г. Чебоксары, Чувашия
L. minor 9.1 г. Канаш, Чувашия L. trisulca 7.1 г. Владимир
L. minor 9.2 г. Канаш, Чувашия L. trisulca 8 г. Тамбовка, Амурская обл.
L. minor 10.1 г. Чебоксары, Чувашия L. trisulca 9.2 пос. Волково, Амурская обл.
L. minor 10.2 г. Чебоксары, Чувашия L. trisulca 11.1 оз. Баланькуль, Хакасия
L. minor 10.6 г. Чебоксары, Чувашия L. trisulca 12 г. Вологда
L. minor 12.3 г. Владимир L. trisulca 13 г. Новосибирск
L. minor 13.1 г. Владимир L. trisulca 14.1 г. Воронеж
L. minor 14.1 г. Владимир L. trisulca 14.3 г. Воронеж
L. minor 16.1 г. Тула L. trisulca 14.4 г. Воронеж
L. minor 17.5 г. Тула L. trisulca 15 г. Новосибирск
L. minor 18.1 г. Вагенинген, Нидерланды L. trisulca 16.1 г. Тамбовка, Амурская обл.
L. minor 29.1 г. Вологда Род Spirodela
L. minor 35.1 г. Барнаул S. polyrhiza 1 г. Сходня, Московская обл.
L. minor36 г. Михайлов, Рязанская обл. S. polyrhiza 3.2 оз. Светлое, Чувашия
L. minor 37.2 г. Новосибирск S. polyrhiza 4.8 г. Чебоксары, Чувашия
L. minor38 г. Новокузнецк, Кемеровская обл. S. polyrhiza 7.7 г. Владимир
L. minor 41 г. Брынь, Калужская обл. S. polyrhiza 9 г. Тамбовка, Амурская обл.
L. minor 43.1 пос. Алферово, Горно-Алтайск S. polyrhiza 10 пос. Гильчиновка, Амурская обл.
L. minor 45.1 г. Воронеж S. polyrhiza 11.6 пос. Волково, Амурская обл.
L. gibba 1.1 г. Хотьково, Московская обл. S. polyrhiza 13 г. Вагенинген, Нидерланды
L. gibba 2.1 г. Сергиев Посад, Московская обл. S. polyrhiza 14.9 г. Благовещенск
L. gibba 2.3 г. Сергиев Посад, Московская обл. S. polyrhiza 15.1 г. Сергиев Посад, Московская обл.
L. gibba 5.1 г. Волгоград S. polyrhiza 16.3 г. Брынь, Калужская обл.
L. gibba 6.1 г. Волгоград S. polyrhiza 17.3 г. Калуга
L. gibba 7.1 г. Воронеж S. polyrhiza 18.2 г. Могилев, Белоруссия
L. turionifera 4 г. Благовещенск S. polyrhiza 19 г. Гомель, Белоруссия
L. turionifera 5.3 г. Новосибирск S. polyrhiza 21 г. Дмитров, Московская обл.
L. turionifera 6.1 г. Космодемьянск, Чувашия S. polyrhiza 22 г. Новосибирск
L. turionifera 7.3 г. Благовещенск Род Landoltia
L. turionifera 8.1 д. Кош-Агач, Респ. Алтай L. punctata 1.2 ГБС, Санкт-Петербург
L. japonica 1.3 с. Толстовка, Амурская обл. L. punctata 2.1 ГБС, Санкт-Петербург
L. japonica 2.5 пос. Волково, Амурская обл.
L. japonica 3 с. Нижний Цасучей, Читинская обл.
L. aequinoctialis 1 Московская обл., Рыб. хозяйство
L. aequinoctialis 2 ГБС, Москва
L. aequinoctialis 5.4 ГБС, Санкт-Петербург
ляющийся также водным растением и характеризующийся редукцией вегетативных органов образец вида Pistia stratiotes (сем. Araceae), родственного Lemnaceae.
Выделение тотальной растительной ДНК производили согласно стандартному протоколу [5] с дополнительной очисткой образцов смесью фенол/хлороформ. В работе использованы восемь стандартных олигонуклеотидных RAPD-праймеров ("Operon Technologies" Alameda, California, USA), которые были предварительно отобраны из 15 прай-меров и оказались наиболее информативными: ОРК6, ОРК8, ОРК10, OPN1, OPN8, OPN14, OPH9, OPD12. Для полимеразной цепной реакции были использованы наборы реактивов производства "Диалат-ЛТД" (Москва). Амплификацию ДНК проводили по стандартной методике [6].
Продукты реакции амплификации разделяли электрофорезом в 1.7%-ном агарозном геле в 1хТВЕ-буфере, с последующим окрашиванием бромистым этидием. В последующий статистический анализ были включены только четкие, воспроизводимые фрагменты.
Статистический анализ проводили при помощи пакетов программ STATISTICA 6.0 и TREECON [7]. Уровень геномной вариабельности оценивали по значениям генетических расстояний (GD). Межродовые, межвидовые и внутривидовые генетические расстояния определяли с использованием коэффициента Жаккарда. Дальнейший кластерный анализ проводился методом UPGMA [8]. Индексы бутстре-па (ИБ) рассчитывались для 1000 реплик.
RAPD-анализ генома 75 представителей Lemnaceae с использованием восьми отобранных праймеров приводил к амплификации 242 RAPD-фрагментов, из которых 201 (83%) были полиморфными.
Для каждого взятого в анализ рода и вида Lemnaceae были выявлены родо- и видоспецифичные RAPD-фрагменты, а также фрагменты, характерные для отдельных растений. При этом общее число родоспецифичных фрагментов составило 10, видоспецифичных - 46 (из них у L. minor - 14 фрагментов, L. trisulca - 12, L. turionifera - 9, S. polyrhiza - 11). Кроме того, были идентифицированы 19 фрагментов, характерных для RAPD-спектров отдельных образцов. Нужно отметить, что у представителей L. japonica и L. gibba специфичных фрагментов идентифицировано не было. Представители L. japonica не отличались видоспе-цифичностью спектров от образцов L. turionifera, так же как и образцы L. gibba от L. minor. В дальнейшем они рассматривались как комплексы видов L. japonica/L. turionifera и L. minor/L. gibba.
Данные проведенного RAPD-анализа были использованы для оценки внутривидовой, межвидовой
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.