БИОЛОГИЯ МОРЯ, 2014, там 40, № 1, с. 70-74
-Краткие сообщения -
УДК 591.169:593.96 БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА WNT5 В ТКАНЯХ ГОЛОТУРИИ EUPENTACTA FRAUDATRIX {DJAKONOV ЕТ BARANOVA, 1958) (HOLOTHUROIDEA: DENDROCHIROTIDA) В НОРМЕ И ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ1
© 2014 г. А. С. Гирич1, И. Ю. Долматов12, Н. Е. Ламаш1
'Институт биологии моря им.А.В.ЖирмунскогоДВО РАН, Владивосток 690041;
2Далъневосточный федеральныйуниверситет, Владивосток 690000 e-mail: astromoon@mail.ru
Статья принята к печати 6.06.2013 г.
Изучено распределение белка Wnt5 в тканях голотурии Eupentacta fraudatrix в норме и при регенерации после эвисцерации. У неповрежденных особей белок Wnt5 обнаружен в одиночных клетках гиподермы и радиальных нервных тяжах. При регенерации число Шп15-положительных клеток возрастало. Они найдены в соединительной ткани стенки тела и зачатка аквафарингеального комплекса, в тканях нервной системы, целомическом эпителии и амёбоцитах. Предполагается, что белок Wnt5 участвует в регуляции восстановительного процесса у голотурии Е. fraudatrix. Процессами, модулируемыми Wnt5, могут быть клеточная миграция, преобразование внеклеточного матрикса и нейрогенез.
Ключевые слова: голотурии, иглокожие, Eupentactafraudatrix, регенерация, эвисцерация, Wnt.
Distribution ofWnt5 protein in tissues of the holothurian Eupentactafraudatrix (Djakonov et Baranova, 1958) (Holothuroidea: Dendrochirotida) in norm and during regeneration. A. S. Girich1,1. Yu. Dolmatov12, N. E. Lamash1 (A.V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology, Far East Branch, Russian Academy Sciences, Vladivostok 690041; 2Far Eastern Federal University, Vladivostok 690000)
The Wnt5 protein localization in holothurian Eupentactafraudatrix tissues was examined in norm and during regeneration. In healthy E.fraudatrix, Wnt5 was found in solitary cells of the hypodermis and in the radial nerve cords. During regeneration, the number of Wnt5 positive cells was increased. They were observed in the connective tissue of the body wall and the pharyngeal bulb, in the nervous system tissues, the coelomic epithelium, and amoebocytes. The Wnt5 protein may participate in regulating the regeneration in the holothurian E. fraudatrix, it probably modulates cell migration, extracellular matrix reorganization, and neurogenesis. (Biologiya Morya, 2014, vol. 40, no. 1, pp. 70-74).
Keywords: holothurians, echinoderms, Eupentactafraudatrix, regeneration, evisceration, Wnt.
Гены семейства wnt кодируют белки - лиганды сигнального пути Wnt, который задействован во многих важных мор-фогенетических процессах, таких как эмбриогенез, канцерогенез и регенерация (Logan, Nusse, 2004; Reya, Clevers, 2005). Например, гены wnt5, wnt8 и -wnt 16 экспрессируются на ранних этапах развития морского ежа Strongylocentrotus purpuratus (Poustka et al., 2007). Экспрессия гена wnt9 была выявлена в процессе регенерации у голотурии Holothuria glaberrima (Ortiz-Pineda et al., 2009). У млекопитающих ген wnt5 экспрес-сируется в различных органах в процессе эмбриогенеза (Martin et al., 2012). При регенерации планарий белок Wnt5 контролирует рост нейронов (Adell et al., 2009). Кроме того, активность Wnt5 была отмечена в опухолях, где этот белок активирует миграцию клеток и приводит к образованию метастазов (Witze et al., 2008).
Голотурия Eupentacta fraudatrix - удобный модельный объект для изучения различных аспектов регенерации (Долматов, Машанов, 2007). У Е. fraudatrix были подробно исследованы клеточные механизмы регенерации основных систем органов (Dolmatov, 1992; Mashanov et al., 2005; Долматов, Машанов, 2007; Garcia-Arraras, Dolmatov, 2010). Ранее с помощью метода масс-спекгрометрии MALDI-TOF в регенерирующих зачаткаи E.fraudatrix мы идентифицировали фрагмент
белка Wnt5, гомологичный участку молекулы Wnt5 морских ежей Heliocidaris erythrogramma и S. purpuratus (100 и 91% гомологии соответственно) (Гирич и др., 2011). В настоящей работе проведено сравнение локализации белка Wnt5 в тканях голотурии E.fraudatrix в норме и на разных стадиях регенерации после эвисцерации.
Материал и методика. Голотурий собирали в зал. Петра Великого Японского моря и помещали в аквариум с аэрируемой морской водой. Эвисцерацию вызывали инъекцией 2-3 мл дистиллированной воды внутрь целома. Животных на разных сроках регенерации (3, 5, 7, 9, 12, 14 и 24 сут после эвисцерации) фиксировали в течение 1 ч при 4°С в 4% параформе на 0.1 М фосфатном буфере. На каждый срок регенерации брали по три особи. Материал отмывали в фосфатном буфере и помещали в среду для приготовления замороженных срезов NEG 50 (Thermo Scientific, USA).
Серийные поперечные срезы передней части голотурий толщиной 5-14 мкм, полученные на криотоме Cryo-Star HM 560 MV (Thermo Scientific, USA), монтировали на предметные стекла, покрытые органосиланом или полилизином (2% органосилан на ацетоне, мол. масса 221). Для выявления белка Wnt5 использовали поликлональные кроличьи антитела к участку молекулы Wnt5 Е. fraudatrix. Синтезированный ис-
1 Исследование выполнено при частичной финансовой поддержке грантов РФФИ (№ 11-04-00408) и ДВО РАН (12-Ш-А-06-088).
кусственный пептид (GTNGSTLMCCGRGYNSFTK) и поли-клональные антитела к нему были получены компанией ООО "РБЛ-Центр" (Русбиолинк). Антитела использовали в разведении 1 : 100. Перед окраской антителами срезы обрабатывали 0.1-0.2% раствором Triton X 100 в течение 30 мин и помещали в 10% раствор BSA на 2 ч. Затем наносили раствор вторичных антител к IgG кролика (0.02 мкг/мл), конъюгированных с Alexa 488 (Invitrogen). Ядра окрашивали флуоресцентным красителем DAPI (1/4000) (Sigma). После этого срезы заключали в 5% N-пропилгаллат на глицерине. Препараты анализировали на конфокальных микроскопах LSM 510 МЕТА и LSM 780 (Carl Zeiss).
Относительное число WntS-положительных клеток определяли как отношение числа меченых клеток к общему числу клеток данной ткани, выраженное в процентах. Для подсчета брали по три среза на каждую стадию регенерации. Изучали соединительную и нервную ткань, поскольку только эти ткани показывали выраженную динамику изменения меченых клеток в течение всего процесса регенерации. Статистический анализ данных проводили с помощью программы Microsoft Excel 2010.
Результаты. Распределение Wnt5 в тканях Е. fraudatrix в норме. У нормальных неповрежденных голотурий клетки, содержавшие продукты гена wnt5, встречались редко. Одиночные Шп15-положительные клетки присутствовали только в соединительной ткани стенки тела (гиподерме) и в эктонейральной части радиальных нервных тяжей (рис. 1,2). Белок Wnt5 в виде характерных мелких гранул равномерно распределялся по всей цитоплазме. В соединительной ткани клетки имели округлую форму, не образовывали отростки (рис. 2А) и располагались преимущественно на внешней границе гиподермы. В нервных тяжах одиночные Wnt5-положительные клетки располагались по периферии эктонейральной части радиальных нервов (рис. 2Б). Они имели длинные отростки, уходившие в глубь тяжа. Кроме того, единичные клетки с меткой были отмечены в цело-мической полости.
Распределение Шп1-5 в тканях Е. /га^аМх при регенерации. На 3-5-е сут после эвисцерации число меченых клеток у голотурий возрастало (рис. 1). В соединительной ткани они образовывали небольшие скопления. По форме эти клетки отличались от таковых в норме: клетки удлинялись, у них появлялись отростки (рис. 2В). Белок присутствовал также в цитоплазме амебоцитов, расположенных в полостях органов амбулакральной системы (рис. 2Г). Отростки некоторых амебоцитов охватывали гемоциты.
В неповрежденной части нервных тяжей антителами окрашивались почти все клетки периферии эктонейральной части радиального нерва (рис. 2Д). Кроме того, белок Шп15 выявлялся и в растущих концах радиальных нервных тяжей, расположенных в зачатке аквафарингеального комплекса (АК) (рис. 2Е). Достаточно интенсивная метка была обнаружена в апикальной части клеток целомического эпителия интеррадиусов стенки тела (рис. 2Ж). В других органах, таких как продольные мышечные ленты, кишечный мезентерий, зачаток АК и целомический эпителий, Шп15-положительные клетки не были выявлены.
На 6-7-е сут после эвисцерации мезентерий, на котором формировался зачаток кишки, содержал многочисленные клеточные отростки, маркировавшиеся антителами к Шп15 (рис. 23). Отростки находились в средней части целомического эпителия и, вероятно, представляли собой аксоны базиэпители-ального нервного плексуса. В самом зачатке кишки и покрывающем его целомическом эпителии Шп15-положительные клетки отсутствовали. Относительное число Шп15-положительных клеток в соединительной ткани увеличивалось до 11 ± 2.3% (рис. 1). Они встречались не только в гиподерме стенки тела, но и во внутренних областях зачатка АК, где были представлены как отдельными клетками, так и достаточно крупными скоплениями (рис. 2И).
На 6-9-е сут после эвисцерации возросла активность экспрессии исследуемого гена в нервной системе. Белок появился в большинстве клеток эктонейрального нервного тяжа
Рис. 1. Изменение относительного числа Wnt5-пoлoжитeльныx клеток в радиальных нервах и соединительной ткани у голотурии Eupentactafraudatrix при регенерации.
а
с;
(А)
&
Г г*
(Б) * *"» А ■
! г 1 -1 - Г^ у
(Г) щ
-' • А 1 *
г Ж'Д: г «Л
/г
(В) - • -
. V.
^ - ■ ^
■ йттШш < А •
Л2& М ф
(Д) ■ , к '"•I 'к 1 ' — ■■
- •V л -' ■ . 1. ■■ г ''
'т. ■' ■ • % ■ - >>. >.
(е) ■ \ - о "* .
/»V * 1 - ■
»■«ГЧм Ч . *
(Ж) 1 л *■ а! V >1 •■1 - р "1 _ ч ■ • ®
г- --л • л' •• • . *
А а' ^' *
(И) 1
ЭН ' ...У;
/
Рис. 2. Распределение Wnt5-пoлoжитeльныx клеток в тканях голотурии ЕиреМаМа/га^аМх. А - гиподерма в норме, Б - радиальный нерв в норме, В - гиподерма на 3-й сут регенерации, Г - ампула амбулакральной ножки на 3-й сут регенерации, Д - радиальный нерв на 3-й сут регенерации, Е - нерв зачатка АК на 3-й сут регенерации, Ж - целомический эпителий на 3-й сут регенерации, 3 - кишечный мезентерий на 7-е сут регенерации, И - зачаток АК на 7-е сут регенерации, К - радиальный нерв на 7-е сут реге
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.