ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 7, с. 930-937
УДК 575:595.773.4
ОБЩАЯ ГЕНЕТИКА
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ МИТОЗОВ В ИМАГИНАЛЬНЫХ ДИСКАХ ЛИЧИНОК Drosophila melanogaster ТРЕТЬЕГО ЛИЧИНОЧНОГО ВОЗРАСТА
© 2007 г. Л. В. Омельянчук1, С. Ноккала2, Я. Маттила3, Л. И. Лебедева1,
Т. Ю. Баймак1, К. А. Ахметова4
1 Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск 630090;
факс: (383) 333-12-78; e-mail: ome@bionet.nsc.ru 2 Department of Biology, University of Turku, Turku 20014, Finland 3 Institute of Biotechnology, University of Helsinki, Helsinki 00014, Finland 4 Новосибирский государственный университет, кафедра цитологии и генетики, Новосибирск 630090
Поступила в редакцию 01.06.2006 г.
Развитие имагинальных дисков дрозофилы сопровождается высокоупорядоченной пролиферацией клеток. Однако различия в топографическом распределении митозов на разных стадиях развития изучены мало. В настоящем исследовании мы проанализировали распределение митозов в крыловом диске личинок третьего личиночного возраста и определили зоны концентрации митозов. Полученные результаты показали, что скорость пролиферации имеет региональную специфичность, определяемую локализацией регуляторов клеточного цикла и/или локализацией факторов роста. Сравнение топографии митозов с паттерном активности регуляторных зон гена string (stg), известного регулятора M-фазы митоза, показало сходство топографии с паттерном активности одной из этих зон. Рассмотрен вопрос о сходстве распределения митозов в левом и правом дисках одной личинки (в сравнении со сходством паттернов экспрессии гена neuralized), а также проанализирована степень фосфорилирования гистона H3 на различных стадиях митоза.
Имеющиеся обширные данные о крыловом имагинальном диске дрозофилы делают его удобной моделью для изучения взаимосвязи клеточной пролиферации и морфогенеза. Так, использование анализа мозаичных клонов позволило определить общие пролиферационные параметры крыла [1], локализовать пролиферационные центры [2, 3], описать контроль регуляции клеточного деления [2] и роль постмитотической подвижности клеток [4]. Было также показано, что соседние клетки организованы в митотические кластеры, в которых клеточные деления проходят синхронно [5]. Тем не менее полное понимание региональной специфичности пролиферации не достигнуто. Так, для определения bona fide ростовых факторов, которые регулируют пролиферацию, необходимо иметь детальную карту распределения митозов в диске.
В настоящем исследовании нами выполнен детальный анализ распределения митозов в имагинальных дисках личинок третьего личиночного возраста. Мы показали наличие зон концентрации митозов, характерных для крылового диска личинок 108-го часа развития после откладки яиц. Районы, в которых сконцентрированы митозы, имеют позиционную корреляцию с интенсивностью региональной экспрессии некоторых регуляторных LacZ-конструктов гена string.
Топография рассматриваемых зон отличается от описанной нами ранее картины распределения районов делящихся клеток в крыловом имагинальном диске 80-96 часов развития, выявленных с помощью анализа мозаичных клонов [3]. Следовательно, позиционный контроль клеточного цикла и собственно митоза различен. Изучение паттерна экспрессии гена neuralized парных дисков (взятых от одной личинки) показало их высокое сходство. В то же время зоны концентрации митозов левого и правого дисков могут существенно различаться. Однако специально разработанная статистическая процедура позволила визуализировать гомологию распределений митозов в этом случае.
Дополнительно мы количественно измерили интенсивность фосфорилирования Н3-гистона на разных стадиях митоза с помощью конфокальной микроскопии и показали, что митоз представляет собой особую траекторию в координатах "флуоресцирующий объем участка ядра"/"интенсив-ность флуоресценции ядра", что может быть полезно при исследовании кинетики митоза.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Личинок Drosophila melanogaster дикого типа (Oregon-R) и линий, содержащих описанные ниже инсерции, выращивали при 25°С до третьего ли-
чиночного возраста (примерно 108 ч после откладки яиц). Репортер neuralized-LacZ (P{ry+t7-2 = = lArB}neurA101 ry506/TM3, ryRK Sb1 Ser1) и репортер string-LacZ (ry506P{PZ}sig01235/TM3, ryRK Sb1 Ser1) были получены из стокового центра Bloomington (номера 4369 и 11525). Регуляторные конструкции, содержащие элементы энхансера гена stg, пришитые к репортерной бета-галактозидазе: P{w+ stg-beta E4.9}, P{w+ stg-beta E6.4}, P{w+ stg-beta E2.6}, P{w+ stg-beta E5.3}, P{w+ stg-beta E6.7}, P{w+ stg-beta R2.2}, P{w+ stg-beta B3.2J} [6], были получены от Dr. Bruce Edgar (Fred Hutchinson Cancer Research Center, USA).
Для культивирования дисков в абдомене взрослых самок имагинальные диски личинок третьего личиночного возраста выделяли в растворе Хенкса и трансплантировали в брюшко самок при помощи стеклянной иглы. Диски культивировали в течение четырех дней, а затем выявляли паттерны экспрессии Lac-Z-репортеров по стандартной методике, как описано ранее [3].
Для визуализации митозов крыловые имагинальные диски окрашивали с помощью антител к Н3-гистону. В экспериментах использовали антитела кролика (anti-H3-p, Upstate Biotechnology) в разведении 1 : 100 и вторичные меченные FITC антитела козы (goat-anti-rabbit IgG, Molecular Probes) в разведении 1 : 200. Препараты заключали в Mowiol, содержащий 5% DABCO, и фотографировали с использованием камеры AxioCam MRc, установленной на микроскопе Axiovert 200 (Carl Zeiss).
Крыловые имагинальные диски, окрашенные mti-Ю-р-антителами, были также проанализированы с помощью конфокального микроскопа Zeiss LSM-510 с использованием следующих параметров: Stack X: 0.07 |m Y: 0.07 |m Z: 0.31 |m, stack size; X: 146.2 |m Y: 146.2 |m Z: 6.0 |m, objective: Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC, average: line4, pinhole: Ch2:70 |m, Filters: Ch2:LP505, beam splitters MBS:HFT488 DBS1:Mirror DBS2:Mirror DBS3:None FW1:None, wavelength: 488 nm. Для каждого диска была построена карта, отражающая не только локализацию, но также и стадию митоза (т.е. профазу, метафазу, анафазу и тело-фазу). Для анализа результатов флуоресцентной микроскопии была разработана специальная программа, позволяющая интегрировать флуоресцентный сигнал от ядра с учетом его распределения по слоям (при этом учитывали суммарную интенсивность сигнала по слоям и флуоресцирующий объем). Коррекцию фона осуществляли на каждом оптическом слое отдельно путем измерений флуоресценции в участке, расположенном вблизи ядра, затем эта величина вычиталась из значения интенсивности флуоресценции для данного оптического слоя. Флуоресцентный объем рассчитывали как число пикселей, интенсивность которых
превышает среднюю величину интенсивности пикселей фона.
Для считывания координат митозов в плоскости имагинального диска профессором Загоруй-ко из Института математики СО РАН была разработана компьютерная программа. Также в работе использована программа, обнаруживающая неслучайные скопления митозов. Участки, имеющие неслучайные скопления митозов, проектировались на карту, аналогичную приведенной в работе Modolell и Campuzano [7].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для анализа неслучайного характера распределения митотических клеток в плоскости имагинального диска мы рассчитали расстояния между всеми парами митозов и представили результат в виде гистограмм (рис. 1). Для сравнения были выполнены случайные генерации распределения митозов в квадрате, имеющем ту же площадь, что и рассматриваемый имагинальный диск, и то же общее количество митозов. Для каждого диска было выполнено 25 случайных генераций (рис. 1). Принимая во внимание то, что форма диска будет сказываться на полученном распределении в том случае, если расстояние между митозами будет сравнимо с размером диска, мы рассматривали только ту часть распределения, которая соответствует малым расстояниям между митозами. Сравнение экспериментальных и теоретических кривых показывает, что имеется участок гистограммы (соответствующий расстояниям 10-40 мкм), где экспериментальная кривая систематически выходит за пределы варьирования теоретических. Следовательно, есть участки ткани, где митозы группируются неслучайно.
Мы провели поиск таких участков с помощью подвижного "окна" с размером ребра 33 мкм (т.е. соответствующего рассматриваемому участку гистограммы), которое перемещалось по диску на 1/3 длины ребра. Для того чтобы определить пороговое значение для случайной кластеризации, провели моделирование на случайном квадрате, как это описано выше. Для каждого положения "окна" было рассчитано число попадающих в него случайных митозов. Согласно распределению Пуассона, вероятность иметь k митозов в квадрате площадью h равна p(k) = ake-a/k\, где a = N • (h/S) и N - число митозов на диск, S - площадь диска. Для каждого диска было проведено 3-5 случайных генераций и выбрано такое значение порога случайности, которое в нашем стохастическом эксперименте можно встретить только в редких случаях. В целом для того чтобы данная группа митозов могла быть рассмотрена как неслучайная, мы потребовали, чтобы p(k) было около 10-4. После выделения таких неслучайных событий спроектировали соответствующие "окна" на кар-
500 400 300 200 100 0
500 400 300 200 100 0
500 400 300 200 100 0
500 400 300 200 100
10 20 30 40 50 60 70 80
Рис. 1. Гистограммы расстояний между парами митозов в крыловом имагинальном диске и их стохастическая симуляция. В области расстояний 10-40 мкм экстремумы экспериментальной кривой (черная линия) систематически превышают значения семейства кривых, полученных в стохастическом моделировании (25 серых кривых). По оси абсцисс - расстояние в микрометрах; по оси ординат - число пар митозов, расстояние между которыми укладывается в данный интервал.
ту диска. Всего в анализе было 50 имагинальных дисков и в 35 случаях обнаружены неслучайные скопления (рис. 2,а), расположенные в постери-ор-области диска, на границе нотум-крыло и в нотуме.
Поскольку известно, что переход клетки в M-фазу связан с активностью гена stg, мы исследовали региональную специфичность активности различ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.