НЕЙРОХИМИЯ, 2015, том 32, № 3, с. 243-251
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 502.084;591.044
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ МОНОАМИНОВ И ИХ МЕТАБОЛИТОВ В СТРУКТУРАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС В ПОЗДНИЕ СРОКИ ПОСЛЕ ОБЛУЧЕНИЯ ИОНАМИ 12C
© 2015 г. К. В. Белокопытова1, О. В. Белов1, *, В. С. Кудрин2, В. Б. Наркевич2, П. М. Клодт2, А. С. Базян3, Е. А. Красавин1, Г. Н. Тимошенко1
Объединенный институт ядерных исследований, Дубна 2Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова", Москва 3Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва
В работе исследован уровень моноаминов и их метаболитов в некоторых структурах головного мозга крыс через 30 и 90 сут после воздействия ионов углерода (12С) с энергией 500 МэВ/нуклон. Линейная передача энергии и доза облучения составляли 10.6 кэВ/мкм и 1 Гр соответственно. Концентрации веществ определялись в пяти структурах мозга, включая префронтальную кору, прилежащее ядро (nucleus accumbens), гипоталамус, гиппокамп и стриатум. На 30-е сут после облучения наиболее выраженные изменения в концентрации моноаминов и их метаболитов наблюдались в прилежащем ядре, более слабые — в гиппокампе и стриатуме. Через 90 сут существенные изменения сохранялись в прилежащем ядре, тогда как в других структурах они становились менее заметными. Сравнение с данными аналогичных экспериментов, выполненных ранее (в острый период — 24 ч после облучения), показало, что наиболее выраженные эффекты наблюдаются в ранние сроки после радиационного воздействия. В поздние сроки происходит восстановление индуцированных нарушений. На основании проведенных исследований сделано предположение о том, что при сравнительно низких значениях линейной передачи энергии частиц (10.6 кэВ/мкм) изменения в метаболизме моноаминов могут быть компенсированы. При более высоких величинах линейной передачи энергии компенсаторно-восстановительные процессы не реализуются, и эффект усиливается со временем. В экспериментах во все сроки после облучения выявлена повышенная чувствительность прилежащего ядра, что может указывать на важную роль этой структуры мозга в радиационно-индуцирован-ном нарушении когнитивных функций и эмоционально-мотивационных состояний.
Ключевые слова: тяжелые ионы, центральная нервная система, моноамины, метаболиты, поздние эффекты.
DOI: 10.7868/S1027813315030024
Исследования нейрорадиобиологических эффектов тяжелых заряженных частиц высоких энергий в последние годы становятся весьма актуальными, что обусловлено необходимостью решения ряда важных научных и практических задач. К ним следует отнести вопросы, возникающие при лечении опухолевых заболеваний головного мозга, аневризма и ряда других патологических процессов пучками заряженных частиц (главным образом, протонов и ионов углерода). Особую значимость эти исследования приобретают при решении задач космической радиобиологии. Прежде всего, они касаются оценки возможного
*Адресат для корреспонденции: 141980, Московская обл., Дубна, ул. Жолио-Кюри, д. 6; тел.: 8(49621)62-847; факс: 8(49621)65-948; e-mail: dem@jinr.ru.
негативного влияния тяжелых заряженных частиц галактических космических лучей (ГКЛ) на формирование структурно--функциональных нарушений в центральной нервной системе (ЦНС) космонавтов при полетах в дальний космос [1, 2]. В ходе пилотируемых межпланетных полетов вы-сокоэнергетичные тяжелые ионы могут представлять высокую опасность для экипажей кораблей. Диапазон энергий частиц, приходящих из глубин галактики, крайне широк и простирается до сверхвысоких энергий порядка 1020 эВ [3, 4]. Обеспечить защиту организма от их повреждающего действия методами физической защиты в ближайшей перспективе не представляется возможным. При прохождении тяжелых ионов через вещество распределение передаваемой энергии
биологическим структурам принципиально отличается от электромагнитных видов ионизирующих излучений. По ходу трека тяжелой заряженной частицы (например, иона железа) через ткани, большой дозе облучения одновременно может подвергнуться несколько тысяч клеток. Специфический характер передачи энергии тяжелыми ионами при прохождении через ткани обусловливает совершенно иной тип радиационного воздействия ГКЛ на организм в условиях полета в дальнем космосе. Это обстоятельство может определять развитие радиационных синдромов, принципиально отличных от наблюдаемых при действии редкоионизирующих космических излучений (например, протонов высоких энергий), что необходимо учитывать при оценке радиационного риска для космонавтов в условиях полета вне магнитосферы Земли.
Закономерности и механизмы формирования структурно-функциональных нарушений, вызванных воздействием тяжелых заряженных частиц высоких энергий, изучены весьма слабо. Практически не исследованы молекулярные и клеточные механизмы, участвующие в реализации высших интегративных функций ЦНС. Известно лишь ограниченное количество наблюдений, касающихся влияния тяжелых ионов на нейрохимические и клеточные механизмы ЦНС, которые могут лежать в основе изменений поведения и памяти, наблюдаемых у экспериментальных животных после облучения. Подробные обзоры известных к настоящему времени эффектов представлены в работах [1, 2, 5].
Особый интерес представляет изучение таких нарушений в поздние и отдаленные сроки после облучения. В предыдущей работе [5] были исследованы ранние изменения в уровнях моноаминов и их метаболитов в различных структурах мозга крыс через сутки после воздействия ионов углерода (12С). Целью настоящей работы являлось исследование таких изменений в поздние периоды после облучения, составлявшие 30 и 90 сут, в аналогичных структурах мозга, принимающих активное участие в реализации поведения и моторного контроля, формирующих эмоциональные и мотивационные состояния.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные. В работе использовано 20 самцов крыс линии Спрег-Доули категории SPF массой 190—210 г в возрасте 7—8 нед. Перед процедурой облучения животные, полученные из Питомника лабораторных животных "Пущино" (г. Пущино), прошли адаптацию к условиям вивария в течение недели, где содержались по пять особей в клетке при естественных условиях освещения (день при-
близительно 8 ч) со свободным доступом к воде и пище. Все процедуры с животными осуществлялись в соответствии с Правилами работы, утвержденными биоэтическими комиссиями Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственного научного центра РФ — Института медико-биологических проблем РАН и Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН.
Процедура облучения. Облучение животных ионами 12C с энергией 500 МэВ/нуклон, линейной передачей энергии (ЛПЭ) 10.6 кэВ/мкм и мощностью дозы 0.03 Гр/мин выполнено на пучке ускорителя "Нуклотрон" в Объединенном институте ядерных исследований (г. Дубна). Крысы в количестве 10 животных подвергались однократному тотальному облучению в дозе 1 Гр. Такое же количество животных использовано в качестве контроля. При этом крысы контрольной группы были подвергнуты "ложному" облучению путем выдерживания животных в сходных условиях, но без воздействия излучения. Измерение поглощенной дозы выполнялось с помощью воздушной ионизационной камеры с размерами чувствительной области 4.2 х 4.2 см2. Для создания квазиоднородного поля излучения пучок ионов расфокусировался магнитными линзами перед местом облучения с тем, чтобы неоднородность поля по координатам X и Y не превышала ±5% в пределах области облучения. Ионизационная камера градуировалась для измерения потока частиц с помощью активационных детекторов или сцинтилляционных счетчиков. Суммарная погрешность определения поглощенной дозы не превышала 10%.
Нейрохимические исследования. Через 30 и 90 сут после облучения животные в количестве по пять облученных и пять контрольных на каждый срок забивались методом декапитации. Выделялись пять следующих структур мозга: префрон-тальная кора, прилежащее ядро (nucleus accumbens), гипоталамус, гиппокамп и стриатум. Выделенные структуры быстро замораживались в жидком азоте и взвешивались. Структуры гомогенизировались при температуре +4°C в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком (0.2 мм) при скорости вращения пестика 3000 об./мин. В качестве среды гомогенизации и выделения использовался 0.1 Н НС1О4 с добавлением внутреннего стандарта ДОБА (3,4-диоксибензиламин) — вещества катехоламиновой природы, но не встречающегося в нативной ткани, в концентрации 0.5 нмоль/мл. Прилежащее ядро гомогенизировалось в 40-кратных объемах, остальные структуры мозга — в 20-кратных объемах среды выделе-
ния. Центрифугирование проб проводилось в течение 15 мин при +4°C и 10000 g. Супернатант использовался в дальнейшем для определения моноаминов и их метаболитов.
Определение концентрации моноаминов и их метаболитов проводилось с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ионопарная хроматография) с электрохимической детекцией на хроматографе LC304T (BAS, West Lafayette, США) с инжектором Rheodyne 7125, петля для нанесения образцов — 20 мкл [5]. Изучаемые вещества разделялись на обращенно-фазной колонке ReproSil Pur, ODS 3, 4 х 100 мм, 3 мкм (Dr.Majsch GMBH, "Элсико", Москва). Насос PM80 (BAS, США), скорость элюции подвижной фазы 1.0 мл/мин при давлении 200 атм. Мобильная фаза — 0.1 M цитратнофосфатный буфер, содержащий 1.1 мМ октансульфоновой кислоты, 0.1 мМ ЭДТА и 9% ацетонитрила (рН 3.0). Скорость протока 1 мл/мин. Измерение проводилось с помощью электрохимического детектора LC4B (BAS, США) на стеклоугольном электроде (+0.85 V) против электрода сравнения Ag/AgCl. Регистрация образцов выполнялась с применением аппаратно-программного комплекса МУЛЬТИХРОМ 1.5 (АМПЕРСЕНД). Для калибровки хроматографа использовались смеси рабочих стандартов определяемых веществ в концентрации 500 пмоль/мл. Величины концентрации моноаминов в опытных образцах рассчитывались методом "внутреннего стандарта", исходя из отношений площади пиков в стандартной смеси и в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.