научная статья по теме РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ТРАНСКРИПТОВ РЕТРОТРАНСПОЗОНА МДГЗ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК Биология

Текст научной статьи на тему «РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ТРАНСКРИПТОВ РЕТРОТРАНСПОЗОНА МДГЗ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2003, том 37, № 4, с. 634-636

== ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА. ПРОТЕОМИКА =

УДК 57.085.23:595.773.4

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ТРАНСКРИПТОВ РЕТРОТРАНСПОЗОНА МДГЗ

В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК

© 2003 г. Б. В. Сёмин*, Ю. В. Ильин

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта Российской академии наук, Москва, 119991

Поступила в редакцию 30.12.2002 г.

Ключевые слова: ретротранспозон, ретровирус.

Ретротранспозон, или эндогенный проретро-вирус, МДГ3 обнаружен в нескольких видах Drosophila. Элемент содержит одну длинную открытую рамку трансляции, в пределах которой находятся гены gag и pol [1]. По расположению функциональных доменов в гене pol его относят к группе gypsy [2]. Существуют две основные формы МДГ3: полноразмерная (5.5 т.п.н.) и укороченная (4.2 т.п.н.) [2]. Полноразмерный элемент обнаружен в геноме D. sechellia, D. yakuba, D. teis-sieri, D. mauritiana, D. similans и D. melanogaster, а укороченный - в различных линиях мух вида melanogaster, при этом соотношение полноразмерной и укороченной форм провируса составляет 15 : 1 [3]. К наиболее значимым структурным особенностям укороченной формы МДГ3 следует отнести делецию домена обратной транскриптазы и части нуклеотидной последовательности, кодирующей РНКазу Н, делецию центральной части домена gag и появление терминирующего кодона ближе к 3'-концу gag [2]. Тем не менее, укороченная форма имеет идентичные длинные концевые повторы и участки, необходимые для транскрипции и обратной транскрипции, такие же, как у полноразмерной формы [2, 4]. По-видимому, транскрипты укороченных копий МДГ3, неспособные к автономной транспозиции, могут подвергаться обратной транскрипции in trans белками, кодируемыми полноразмерным элементом.

Действительно, при переводе клеток дрозофилы в культуру (когда обычно происходит значительная амплификация многих ретроэлементов генома [5]) наблюдается и амплификация укороченной формы МДГ3 [3, 4, 6]. В культивируемых клетках линии 67j25D количество копий полноразмерной формы существенно больше, чем укороченной [3, 6]. Предполагается, что несмотря на значительную амплификацию провируса, соотношение двух форм МДГ3 остается таким же, как и в исходной линии мух, послужившей источником

* Эл. почта: syomin@genome.eimb.relarn.ru

для культуры клеток. Мы сравнили распределение транскриптов полноразмерной и укороченной форм МДГ3 в линии клеток 67]25В, чтобы определить возможность использования этой линии в качестве модельной системы для изучения механизма регуляции ретроамплификации двух форм МДГ3.

Методы культивирования клеток дрозофилы линии 67]25Б, получения клеточных и внеклеточных частиц МДГ3, выделения из них РНК, Сау-зерн- и Нозерн-анализа описаны ранее [7]. РНК из клеток выделяли, используя гуанидин-НС1 [8]. Выделение полиаденилированной РНК и обработку КаОИ проводили согласно [9, 10]. Аминокислотную последовательность анализировали, используя нук-леотидную последовательность полноразмерной копии МДГ3 (код в базе данных Х95908).

Несмотря на то, что содержание укороченных копий в геноме значительно меньше, чем полноразмерных (рисунок, а), количество транскриптов, синтезируемых с них, в клетке не столь резко отличается от количества транскриптов полноразмерных копий элемента (рисунок, б, 1). Такое распределение может отражать более активную транскрипцию укороченных копий по сравнению с полноразмерными провирусами. Нас в первую очередь интересовали транскрипты, участвующие в образовании вирусных частиц. Во фракции внеклеточных частиц обнаружена практически только РНК полноразмерного МДГ3 (рисунок, б, 2), в то же время фракция цитоплазматических частиц содержала оба вида транскриптов (рисунок, б, 3). Известно, что при образовании вирусной частицы на РНК ретротранспозонов начинается процесс обратной транскрипции, который приводит к образованию полноразмерной гибридной молекулы РНК-ДНК, и часть частиц содержит такие молекулы [9-11]. Обработав препарат суммарной полиаденилированной клеточной РНК перед проведением электрофореза в денатурирующих условиях щелочью, мы обнаружили полноразмерную (-) цепь ДНК как укороченной, так и полноразмерной формы элемента (рисунок, б, 4), а в препарате средовых частиц, обработанных щелочью,

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ТРАНСКРИПТОВ РЕТРОТРАНСПОЗОНА МДГЗ

635

зона гибридизации выявляется только в области, соответствующей полноразмерным транскриптам (рисунок, б, 5). Аналогичный результат получен и при обработке препарата РНКазой в растворе с низкой ионной силой (0.1 х SSC) (данные не приведены).

Проведенный анализ показал, что часть транс-криптов укороченного МДГ3 участвует в обратной транскрипции. Следуя ранее сделанному выводу [3], мы считаем, что транскрипты укороченной копии используют обратную транскриптазу, кодируемую полноразмерным элементом. Обратная транскрипция инициируется в нуклеопро-теиновой частице, образуемой транскриптом рет-ротранспозона и структурным полипротеином Gag, который на инициирующей стадии связывается с ограниченным числом участков на 5'-конце РНК [12, 13]. Исходя из того, что в культуре клеток отмечены различия в распределении транс-криптов полноразмерной и укороченной форм элемента, вовлеченных в образование вириона, можно предположить, что эти два вида транс-криптов образуют различные частицы. Секвени-рование нескольких укороченных копий МДГ3 показало, что эта форма кодирует основной структурный белок вириона - Gag, который содержит делеции [2, 4] и поэтому может рассматриваться как дефектный. Именно дефектностью структурного белка, кодируемого укороченной копией и образующего вирион с укороченной РНК, можно объяснить отсутствие транспорта из клетки частиц, образуемых этой формой.

Полученные результаты указывают на транспорт из клетки частиц, образуемых полноразмерным МДГ3. Такой вывод согласуется с недавно полученным доказательством того, что частицы полноразмерной формы МДГ3 способны переносить элемент в соматические клетки неродственных видов [7]. В последние годы на примере вирусов позвоночных получено большое число доводов в пользу того, что продукты вирусных генов взаимодействуют с некоторыми белками, регулирующими транспорт белков в клетке-хозяине и эндоцитоз [13, 14]. Возможно, определенные пептиды, кодируемые единственной длинной рамкой считывания МДГ3, также могут связываться с клеточными белками для осуществления транспорта частиц этого элемента из клетки.

Несомненно, подробное изучение необычного эндогенного ретровируса МДГ3, способного к межвидовому переносу, заслуживает серьезного внимания. Окончательный ответ на вопрос о механизмах транспорта из клетки частиц МДГ3 может быть получен в результате детального экспериментального изучения процессинга полипроте-

1 2 3 4 5

а б

1

Гибридизация МДГ3 с геномной ДНК, обработанной рестриктазой НМП1, (а) и гибридизация МДГ3 с препаратами РНК (•). 1, 4 - суммарная полиаденилиро-ванная РНК из клеток, 2, 5 - из средовых частиц, 3 -из внутриклеточных частиц. Препараты на дорожках 4 и 5 обработаны щелочью перед электрофорезом. Стрелками отмечены зоны гибридизации, соответствующие подвижности полноразмерной и укороченной форм элемента.

ина, кодируемого единственной длинной рамкой трансляции.

Работа проведена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (02-04-48282 и 03-04-4814) и Программы поддержки "Ведущих научных школ" (НШ-1792.2003.4).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Аведисов С.Н., Ильин Ю.В. 1995. Ретротранспозон дрозофилы МДГ3: общая структура и функциональные домены полноразмерной копии. ДАН. 344, 823-826.

2. Аведисов С.Н., Кузин А.Б., Ильин Ю.В. 1997. Молекулярный анализ полноразмерной и делетиро-ванной копий ретротранспозона дрозофилы МДГ3. Молекуляр. биология. 31, 950-955.

3. Аведисов С.Н., Зеленцова Е.С., Ильин Ю.В. 1998. Транс-мобилизация делетированных копий ретротранспозона МДГ3 в культивируемых клетках дрозофилы. Генетика. 34, 335-342.

4. Джумагалиев Е.Б., Мазо А.М., Баев А.А., Горелова Т.В., Архипова И.Р., Шуппе Н.Г., Ильин Ю.В. 1986. Структура длинных концевых повторов транскрипционно активных и неактивных копий

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ том 37 < 4 2003

636

СЁМИН, ИЛЬИН

мобильного диспергированного гена МДГ3 Droso-phila melanogaster. Генетика. 22, 368-377.

5. Ильин Ю.В. Мобильные диспергированные гены эукариот. В кн.: Итоги науки и техники. T. 18. Сер. Молекулярная биология, M.: ВИНИТИ. 1982.

6. Ильин Ю.В., Шуппе Н.Г., Любомирская Н.В., Горелова Т.В., Архипова И.Р. 1984. Кольцевые ДНК мобильных диспергированных генов в культуре клеток Drosophila melanogaster. Генетика. 20, 1763-1771.

7. Syomin В., Leonova T., Ilyin Y. 2002. Evidence for horizontal transfer of the lTr retrotransposon mdg3 that lacks an env-gene. Mol. Genet. Genomics. 267. 418-423.

8. Ausubel F.M. 1994. Current protocols in molecular biology. Preparation and analysis of RNA. N.Y.: John Wil-ley & Sons. Inc.

9. Syomin B.V., Kandror K.V., Semakin A.В., Tsyprun V.L., Stepanov A.S. 1993. Presence of gypsy (mdg4) retrotransposon in the extracellular virus like particles. FEBS Lett. 323, 285-288.

10. Сёмин Б.В., Кандрор K.B., Семакин A.B., Цуп-рун В.Л., Степанов А.С. 1994. Исследование некоторых биохимических характеристик вирусоподобных частиц gypsy (МДГ4). Биохимия. 59, 363-369.

11. Arkhipova I.R., Mazo A.M., Cherkasova V.A., Gorelo-va T.V., Schuppe N.G., Ilyin Y.V. 1986. The steps of reverse transcription of drosophila mobile dispersed genetic elements and U3-R-U5 structure of their LTRs. Cell. 44, 555-563.

12. Darlix J.-L., Lapadat-Tapolsky N., de Rocquigny H., Roques B.P. 1995. First glimpses at structure-function relationships of the nucleocapsid protein of retroviruses. J. Mol. Biol. 254, 523-537.

13. Сёмин Б.В., Ильин Ю.В. 2003. Эрантивирусы дрозофилы. Генетика. 39, 657-663.

14. Vogt V. 2000. Ubiquitin in retrovirus assembly: actor or bystander? Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 1294512947.

Proportion of Retrotransposon mdg3 Transcripts in Cultured Cells

B. V. Syomin and Yu. V. Ilyin

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia;

E-mail: syomin@genome.eimb.relarn.ru Rece

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком