ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 579.266574.2357.065
РАСПРОСТРАНЕНИЕ, РАЗНООБРАЗИЕ И ЧИСЛЕННОСТЬ МЕТАНОГЕННЫХ АРХЕЙ В НАЗЕМНЫХ ГОРЯЧИХ ИСТОЧНИКАХ
КАМЧАТКИ И ОСТРОВА САН-МИГЕЛЬ © 2015 г. А. Ю. Меркель1, О. А. Подосокорская, Н. А. Черных, Е. А. Бонч-Осмоловская
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 04.12.2014 г.
Путем детекции и анализа гена тсгА, кодирующего ключевой фермент метаногенеза — метил-коэн-зим М-редуктазу, проведена оценка распространения и разнообразия метаногенных архей в наземных горячих источниках Камчатки и о. Сан-Мигель (Азоры). Для этого предварительно была проведена реконструкция филогении метаногенов на основании анализа последовательностей гена тсгА, являющегося общим функциональным и филогенетическим маркером этой физиологической группы прокариот. Установлено, что метаногены присутствуют в большинстве исследованных наземных горячих источников с температурами в диапазоне 51—89°С, но составляют при этом незначительную часть микробной популяции. Обнаруженные в образцах из горячих источников гены тсгА принадлежали как представителям родов МеМапоМегтоЬаМег, МеМапо^егтт и Ме^апо^пх, выявленных ранее в этих же местообитаниях, так и метаногенам, ранее в горячих источниках не обнаруженным. Среди последних — представители МеМапотаззПпсоссакз, Ме(капосе11а1е$ и Ме^апотеШуЬуогат, а также новый филогенетически обособленный кластер некультивируемых метаногенных архей — МСЯ-2а, причем последняя группа присутствовала во всех источниках с положительным результатом детекции гена тсгА. Проведенные исследования свидетельствуют о разнообразии термофильных метаногенов, обитающих в наземных горячих источниках, и наличии среди них новых групп с неизвестной пока субстратной специфичностью.
Ключевые слова: метаногенные археи, наземные горячие источники, ген тсгА, филогенетическая реконструкция, кластер некультивируемых метаногенов МСЯ-2а.
DOI: 10.7868/S0026365615040138
Процессы образования и окисления метана — это количественно значимые компоненты глобального цикла углерода на Земле, и, по-видимому, они являлись таковыми на протяжении всего времени существования биосферы нашей планеты [1]. Метаногенные микроорганизмы трансформируют в метан около 2% всего углерода, фиксируемого фотосинтезирующими организмами [1]. По другим оценкам, ежегодно в атмосферу попадает 500—600 Тг метана [2, 3], при этом около 70% метана, попадающего в атмосферу, образуется в результате жизнедеятельности современных микробных сообществ [4].
Использование гена 16S рРНК для детекции и идентификации метаногенных архей в сложных микробных сообществах затруднено, поскольку эта физиологическая группа не является монофи-летичной [5, 6]. В связи с этим внимание ряда исследователей было обращено на ген, кодирующий а-субъединицу метил-коэнзим М редуктазы
1 Автор для корреспонденции (e-mail: alexandrmer-kel@gmail.com).
(тсгА) [7, 8]. Результаты, полученные во многих работах, подтвердили эффективность использования данного функционального и филогенетического маркера для оценки разнообразия и распространения метаногенов [9, 10].
Для некоторых термальных экотопов, а именно нефтяных месторождений, гидротермальных осадков, "черных курильщиков", уже был проведен ряд исследований разнообразия и распространения метаногенных архей [11—15]. Вместе с тем, наземные горячие источники остаются слабо изученными в этом отношении экотопами.
Первое свидетельство присутствия метаноге-нов в наземных горячих источниках было получено при исследовании этих местообитаний в Йелло-устоунском национальном парке [16]. В последующих работах из гидротерм Исландии были выделены два гипертермофильных гидрогенотрофных ме-таногена, представляющих новое семейство МеЛапоЛегтасеае — МеЛапоЛегтт feгvidus и М. зоааЫШ [17, 18], для которых позже было показано, что они являются эндемиками острова [15].
7
485
С помощью радиоизотопных методов интенсивный процесс образования метана был зарегистрирован и в горячих источниках Камчатки [19, 20]. Во всех накопительных культурах, использующих водород, из источников, где удалось детектировать образование метана, наблюдался рост тонких гидрогенотрофных палочек, фенотипически сходных с представителями рода Methanothermo-bacter [21]. Кроме того, в 1982 г. Ножевниковой и Ягодиной была опубликована работа о новом нитчатом организме, выделенном из ила термального озера — Methanothrix thermoacetophila — неспособном к использованию водорода, но растущем на ацетате с образованием метана [22]. Таким образом, к настоящему моменту разнообразие выделенных из наземных горячих источников метаногенов сводится к представителям родов Methanothermo-bacter, Methanothrix и Methanothermus.
Целью данной работы была молекулярная детекция, идентификация и количественная оценка метаногенных архей в наземных горячих источниках полуострова Камчатка (Россия) и острова Сан-Мигель (Португалия).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Место отбора, отбор и хранение образцов. В ходе данного исследования анализировались пробы, полученные из двух районов полуострова Камчатка — кальдеры Узон и Долины гейзеров (Россия), а также острова Сан-Мигель (Азоры, Португалия). Отбор образцов воды, осадков, илов, бактериальных матов или обрастаний из наземных горячих источников проводили в стерильные 15 и 50 мл пластиковые пробирки типа Falcon либо в стеклянные флаконы объемом 60 мл. Пробирки или флаконы полностью заполняли образцами, плотно закрывали и доставляли в лабораторию для дальнейших исследований. До момента анализа пробы хранились асептически в холодильнике при 4°С.
Молекулярные методы. ДНК из образцов выделяли на основе стандартных методов [23, 24]. Для выделения ДНК образец ресуспендировали в равном объеме лизирующего раствора (0.15 M NaCl, 0.1 M Na2EDTA, pH 8.0), содержащего 15 мг/мл лизоцима, после чего образец гомогенизировали, используя для разрушения клеток стеклянные шарики различного диаметра и гомогенизатор FastPrep® 24 ("MP Biomedicals", США). Полученную смесь инкубировали при 37°C (40 мин), тщательно встряхивая лизат каждые 10 минут. После этого добавляли аналогичное начальному количество буфера, содержащего 0.1 M NaCl и 0.5 M трис-Hci (pH 8.0), и додецилсуль-фат натрия до конечной концентрации 0.5%. Протеиназу К вносили до конечной концентрации 100 мкг/мл, после чего лизат инкубировали в течение 40 мин при 50°C и затем 10 мин при 60°C.
Эффективность лизиса определяли методом подсчета клеток на световом микроскопе с фазо-во-контрастным устройством. Затем ДНК из ли-зата экстрагировали стандартным методом фенол-хлороформной экстракции. Для осаждения ДНК использовали 96% этиловый спирт. Осадок ДНК растворяли в ТЕ буфере (10 мМ трис-HCl, 1 мМ EDTA, pH 8.0). Получившийся раствор ДНК очищали от примесей РНК путем инкубации с РНКазой А (конечная концентрация 0.2 мг/мл) в течение 2 ч при 37°C. Также при необходимости ДНК чистили с помощью набора для очистки крупных фрагментов ДНК Wizard® DNA Clean-Up System ("Promega", США). Качественную и количественную оценку полученных препаратов ДНК проводили на спектрофотометре DropSense-96® ("Trinean", Бельгия).
ПЦР-амплификацию, гель-электрофорез, клонирование, денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ), количественную ПЦР проводили согласно общепринятым методикам [23, 25—27]. Первичный скрининг метаногенов проводили с использованием двух систем прай-меров, специфичных к гену mcrA: MLf—MLr [9] и mlas-mcrA-rev [28].
Количественную ПЦР проводили с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green I® и готовой смеси для ПЦР qPCRmix-HS SYBR ("Евроген", Россия) на приборе StepOne-Plus® RealTime PCR System ("Life Technologies", США). Коэффициент корреляции для всех калибровочных кривых был не ниже 0.97, а эффективность реакции не ниже 70%.
При проведении количественной ПЦР с целью оценки метаногенных архей, архей в целом и бактерий в пробах из источников Термофильный, Заварзина и 2012 были использованы три системы праймеров: mlas (F)-mcrA-rev, Arch931F-Arch1100R и Bact338F-Bact907R соответственно [26, 29-31].
Анализ полученных нуклеотидных последовательностей. Нуклеотидные последовательности редактировали и собирали в программе BioEdit 7.1.3 [32], транслировали в аминокислотные последовательности, выравнивали в программе ClustalW [33], объединяли в репрезентативные операционные таксономические единицы (ОТЕ) в программе cd-hit [34]. Совокупность всех полученных ОТЕ была проверена на наличие химер с помощью программы Pintail [35]. Филогенетическая реконструкция проводилась в программе ARB [36] с использованием алгоритма maximum-likelihood и непараметрического bootstrap анализа (100 повторов).
Тф 3в 18 31 Бр к. Бр р. П.г Кух 20 12 22 02 22 05 22 09 22 13
Methanosarcinales i— Methanosarcinac — - ANME-2 eae
66% Methanotrix 21
Methanocellales 91%,- -h---- l""% Methermicoccus ----- - - Unclassified Methanosarcini Methanocellales les 1
Methanomicrobiales mrtA ч ■-- I— Methanobacterium mrtA Methanomicrobiales -M-Уй
I 100% Methanothermobacter mrtA
_ —Methanosphaera mrtA ^ Methanocaldococcus mrtA
Methanococcales -95% Methanococcales
Methano-bacteriales ,„, 76% 92% ..................... Methanobacterium & Methanobrevibacter H 1
L Methanothermobacter 1
'""% Methanothermus
L-99% Methanopyrales
Uncultured 100%I 90% 77% -^ 100% ANME-1 Lost City group " Methanomassiliicoccales
72% - MfR-2a 0.10 1 Тф |31|к.|р.Г 1 I2I02I05I09I13
Рис. 1. Филогенетическое дерево, построенное на основе сравнительного анализа аминокислотных последовательностей а-субъединицы метил-коэнзим М редуктазы и отображающее положение выявленных в ходе данного исследования ОТЕ. Дерево построено в программе ARB с использованием алгоритма maximum likelihood и bootstrap анализа (100 повторов, значения ниже 50% не показаны). Справа в виде таблицы черными квадратами обозн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.